代谢biomarker筛选是疾病早期筛查和预后评估的重要手段，一组有效的代谢Biomarker筛选是一个漫长且艰难的过程。从临床样本的选择、队列分组到实验思路设计再到大量的数据分析均是生物标志物筛选缺一不可的关键环节。到底应该如何筛选并对临床样本进行分组？如何设计严谨的筛选-验证实验？如何评估标志物的诊断效能？本期我们选择5篇临床biomarker筛选文章，看完这个系列，相信以上问题都会迎刃而解。
临床biomarker专题
文章1. 增强HBV-ACLF预后的生物标志物筛选
文章2. 频发型与偶发型痛风患者的血清代谢标志物新发现
文章3. 结直肠癌的基于菌群和血清代谢物的诊断模型建立
文章4. 脂质组学生物标志物:尿双酚A暴露与结直肠癌之间的潜在介质
文章5. 肝细胞癌早期检测的大规模、多中心血清代谢物生物标志物鉴定
文献解读 | (IF=13.6)脂质组学生物标志物:尿双酚A暴露与结直肠癌之间的潜在介质
结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)已经成为世界上第三大常见肿瘤和第二大死亡原因。研究表明双酚A(Bisphenol A, BPA)暴露与某些恶性肿瘤发病率之间的关联，但其潜在机制尚不明确。本研究旨在探讨高剂量BPA对CRC患者脂质改变的影响，以及肿瘤组织脂质代谢在BPA与CRC之间关联的作用。研究发现，癌组织代谢物可能在BPA暴露负荷和CRC风险关联中发挥重要的桥梁作用。这项研究将为BPA的致癌作用提供依据，并有助于我们深入了解外界胁迫诱发CRC的病因。
BPA暴露与结直肠癌的关系
根据87例CRC患者和130例健康对照组的研究对象特征可见二者的BPA接触负荷差异有统计学意义(P < 0.05)（表1）。CRC患者组的BPA检出率为88.5%，尿浓度中位数为1.92µg/g(四分位数差(IQR): 0.76, 4.06)；对照组的BPA检出率为93.8%，尿浓度中位数为1.65µg/g (IQR: 0.99, 2.36)。
表1 CRC组与对照组常规特征的比较
以4.21 μg/g为截止尿浓度，将CRC患者的BPA暴露水平分为低、高两组，将性别、年龄、BMI、区域淋巴结、等因素作为因变量纳入多元逻辑回归模型。从表2可看出，与低组相比，高组患者肿瘤大小更大，病理浸润分期、转移距离和分化程度更高(P < 0.05)。
表2 按BPA暴露水平分组的CRC参与者特征比较
研究发现尿液的BPA浓度与CRC呈正相关(P < 0.05)。三种血清肿瘤标志物(CEA、CA125、CA19-9)的检测结果作为CRC的预后指标。相对于作为参考的第一个三分位数，BPA 浓度最高三分位数的调整后优势比 (OR) 为 4.45（95% CI：1.31，15.14），表明BPA暴露是CRC进展的积极危险因素(图1)。
图1 尿BPA浓度与CRC的相关性
CRC组织及邻近组织的脂质组学分析
进行非靶向脂质组学分析，在CRC组织和邻近组织之间共检测到2910种相同的脂质代谢物。进一步筛选(P < 0.05, fold change > 2)，从肿瘤及癌旁组织中筛选得到145种不同的差异脂质代谢物，这些物质主要由磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine，PC)和磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)组成，此外还包括甘油三酯(Triglyceride, TG)、磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol，PG)以及鞘磷脂(Sphingomyelin，SM)等（图2）。
图2 癌组织和癌旁组织中差异脂质代谢物的分布及含量变化
将以上145个差异脂质分子在KEGG网站上进行富集，得到6条代谢途径，其中甘油磷脂代谢途径的重要性最高(P < 0.05)。这表明，在CRC中，甘油磷脂途径在PC和PE两个映射位置上受到显著干扰（图3）。根据P值和VIP值进一步筛选得到25种脂质。聚类分析显示，癌组织与癌旁组织的脂质代谢物呈明显差异的病毒化趋势，癌组织中PC、PE、PG含量升高，而TG含量降低（图4）。然后将这25种显著差异的脂质代谢物进行受试者工作特征曲线分析(Receiver Operating Characteristic, ROC)。CEA、CA125和CA19-9的曲线下面积(Area Under Curve, AUC)分别为0.757、0.707和0.854 (P< 0.05，图5)。从数值来看，CA19-9是最可能与脂质代谢物改变有关的血清肿瘤标志物。这些结果表明，脂质代谢物的改变可能影响CRC的发生和发展。
图3 不同通路中的拓扑映射图
图4 癌旁组织和癌组织中的差异脂质代谢物变化趋势
图5 由25种显著差异的脂质代谢物预测的ROC曲线组图
BPA与CRC中脂质代谢物的关系
正交偏最小二乘法判别分析(OrthogonalPartialLeast Squares-DiscriminantAnalysis， OPLS-DA)发现在高BPA组中，癌旁组织和癌组织之间的脂质代谢差异非常接近，而在低BPA组中观察到癌旁组织和癌组织脂质代谢存在明显的差异（图6）。在偏最小二乘判别分析(Partial Least-Squares Discriminant Analysis, PLS-DA)中也观察到类似的现象。这也表明高剂量BPA组CRC可能有更高的进展程度和更大的风险。
图6 癌组织和癌旁组织中的145种差异脂质代谢物OPLS-DA模型评分图
将筛选得到的25种差异脂质代谢物用于进一步研究BPA暴露对CRC进展的影响。通过聚类分析脂质代谢物的峰面积比（癌症/癌旁），以寻找不同 BPA 水平下脂质代谢过程的变化（图7 A）。高BPA组PC、PE和PG含量明显升高，TG含量降低，说明其可能参与BPA与CRC进展的关系。分析BPA与不同脂质分子之间的相关性。高BPA组TG(56:4)降低，相关性系数为-0.242，而高BPA组溶血磷脂酰胆碱LPC(14:0)、PC(32:0)、PC(34:0)、PC(37:1)、PC(38:4)、PC(42:1)、PE (32:1 P)、PE(34:2)、PE (40:4e)、PG(38:3)显著升高，这12种显著不同的脂质代谢物可能作为BPA暴露后CRC的脂质生物标志物（图7 B）。
图7 A.差异脂质代谢物在高低BPA组中的变化趋势；B.高BPA与不同脂质代谢物含量变化的相关性
脂质代谢物在BPA暴露与血清肿瘤生物标志物之间的桥梁作用
BPA、脂质和CRC之间的成对相互作用表明这些因素之间可能存在潜在的相互联系，因此研究者进行了中介分析，以探讨这些脂质代谢物是否可能介导BPA与肿瘤生物标志物之间的正相关。在肿瘤组织中，BPA暴露与血清肿瘤标志物异常在BPA - PC (34:0) - CA125、BPA - PC (37:1) - CA19-9、BPA - PE (34:2) - CEA、BPA - TG (56:4) - CEA中脂质代谢变化的中介效应值与总效应值之比分别为0.116、0.187、0.216、0.146，分别占总效应的21.9%、18.7%、18.4%、27.39%。这四种脂质代谢物对BPA暴露后结直肠癌有部分介导作用。而有趣的是，在邻近组织BPA - TG (56:4) - CEA中，效应量为0.216，占23.87%(表3)。与邻近组织TG(56:4)相比，效果明显增强。这些数据表明，PC(34:0)、PC(37:1)、PE(34:2)和TG(56:4)可能是潜在的有效脂质生物标志物，在结直肠癌BPA暴露过程中发挥重要作用。
表3 脂质代谢物在BPA暴露与血清肿瘤生物标志物之间的桥梁作用
1.使用非靶向代谢组学分析筛选不同组织之间的差异脂质；
2.通过单元变量和多元变量统计分析再结合通路富集分析和聚类分析发现PC(34:0)、PC(37:1)、PE(34:2)和TG(56:4)在BPA和CRC风险之间发挥了潜在的桥梁作用；
3.在人类研究中，环境污染物通过脂质代谢改变对CRC的影响可能为CRC诊断的新效应生物标志物提供工作流程，这些发现有助于我们深入了解外界胁迫诱导CRC的病因。
