代谢biomarker筛选是疾病早期筛查和预后评估的重要手段，一组有效的代谢Biomarker筛选是一个漫长且艰难的过程。从临床样本的选择、队列分组到实验思路设计再到大量的数据分析均是生物标志物筛选缺一不可的关键环节。到底应该如何筛选并对临床样本进行分组？如何设计严谨的筛选-验证实验？如何评估标志物的诊断效能？本期我们选择5篇临床biomarker筛选文章，看完这个系列，相信以上问题都会迎刃而解。
临床biomarker专题
文章1. 增强HBV-ACLF预后的生物标志物筛选
文章2. 频发型与偶发型痛风患者的血清代谢标志物新发现
文章3. 结直肠癌的基于菌群和血清代谢物的诊断模型建立
文章4. 脂质组学生物标志物:尿双酚A暴露与结直肠癌之间的潜在介质
文章5. 肝细胞癌早期检测的大规模、多中心血清代谢物生物标志物鉴定
文献解读 | (IF=29.4)结直肠癌的基于菌群和血清代谢物的诊断模型建立
结直肠癌(Colorectal Cancer, CRC)是一种常见的消化道恶性肿瘤。研究表明与CRC相关的异常肠道微生物组或循环代谢组，但获取地域一致的CRC相关特征仍是一个挑战。在本研究中，作者结合宏基因组学和代谢组学分析，获得了CRC的跨队列肠道微生物组特征，揭示了其中一些微生物与CRC相关的血清代谢物之间的关联，并建立了基于肠道微生物和血清代谢物的诊断模型。
实验设计
研究结果
结直肠腺瘤和结直肠癌的肠道微生物组特征
收集健康组(Healthy Control, HC)(n=91)、结直肠腺瘤组(Colorectal Adenoma, CRA)(n=63)和结肠直肠癌组(colorectal cancer, CRC)(n=71)的粪便样本进行宏基因组测序发现在门、属和种水平上检测的β-多样性有显著性差异（图2 A-C），三组的厚壁菌门、疣微菌门、放线菌门是Shannon-Wiener指数的正向贡献者，拟杆菌门是负向贡献者（图2 D）。与CRC发病机制相关的微生物组成发生了重大变化（图2 E）。
图1. HC、CRA和CRC组之间的基因数目和多样性指数分析
图2. 健康对照组和CRA组、CRC组之间的肠道微生物群
结直肠癌在不同阶段的分类变化
将患者分为不同的病理阶段（CRA和CRC阶段 （Ⅰ-Ⅳ）），发现各阶段或组合阶段（早期或Ⅰ~Ⅱ阶段、晚期或Ⅲ~Ⅳ阶段）的微生物结构无显著差异。在46种CRC相关微生物中，有6种（厌氧胃链球菌、嗜乳杆菌、阴道加德纳菌、阴道托波菌、1型巨孢子菌和腐蚀艾肯菌）CRA与CRC I期存在显著差异，这些细菌可能是癌症早期阶段的预测因子。对比CRC各阶段（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ）与HC、CRA之间差异微生物的数量，发现CRCⅡ阶段是CRC发展阶段中成分变化的主要时间点。
结直肠腺瘤和结直肠癌中血清代谢物的变化
通过UPLC-MS/MS对CRA或CRC与HCC之间的血清进行非靶代谢组学分析，结果表明总循环代谢组和8个超通路存在显著性差异（图3 A-I）。同时，本文鉴定了一些阶段性特异代谢物（如Ⅰ阶段的N-甲基脯氨酸，Ⅲ阶段的熊去氧胆酸），可以作为致病阶段的诊断靶点，而天冬氨酸、(N(1)+N(8))-乙酰亚精胺等CRA/CRC的共同特异代谢物可以作为对阶段致病不敏感的诊断靶点。
图3. 基于Adonis的总循环代谢组和8个超级代谢途径中代谢物的PCA分析
结直肠癌的交叉队列肠道微生物组及其与循环代谢物的关系
将上海队列的内部微生物组与来自7个地区已发表CRC数据集中进行交叉验证，发现上海队列中的许多微生物和代谢特征异常现象与其他区域CRC人群中的一致。
肠道微生物组特征与血清代谢物之间的广泛相关性
致癌作用发生中涉及大量的微生物-代谢物相互作用，CRA和CRC 中发现的微生物-代谢物关联证明了这一点（图4 A-C）。例如，CRC富集的核梭杆菌、胃链球菌、 消化链球菌表现出广泛代谢耦联，其中包括一些与胰管腺癌、肺癌、前列腺癌有关的代谢物（图4 D）。此外，作者将差异倍数FC> 1.2的差异血清代谢物通过Metacyc数据库进行代谢通路分析，揭示了15个代谢物与4个微生物组超通路的联系（图5）。由此可知，CRC患者的肠道微生物组功能异常与血清代谢组异常有关。
图4. CRC肠道微生物与血清代谢物的关联
图5. CRC循环代谢物与Metacyc数据库中相关代谢途径的相关性
开发具有可靠诊断性能的微生物-代谢物复合检测组
从内部队列中招募了有宏基因组和代谢组学数据的参与者（n=100）。从整个内部队列筛选出的12种肠道微生物（图6 A-C）在100个个体的部分数据集中产成的AUROC值为0.959（图7）。通过交叉验证检验该组（n=100）对CRA和CRC各阶段的预测能力（图6 F），发现参与者组保持了整个内部队列的宏基因组特征。同时，作者基于部分内部队列的随机森林排序筛选出3种代谢物可作为预测CRC的标志物（图8 A、B）：N(1)+N(8)-乙酰亚精胺、2-亚油酰甘油(18:2)、全氟辛烷磺酸（图8 C、D）。该标志物组在部分训练集和独立代谢验证队列中的AUROC值为0.967和0.821，用于区分CRC各阶段与HC的AUROC值为0.744-0.893（图8 E-G）。
图6. 基于肠道菌群的CRC预测模型
图7. 在子集（n=100）队列中，从内部群组鉴定的12个生物特征来区分CRC和HC的AUROC值
结合上述微生物和代谢特征生成了一个复合检测组（12种微生物+3种代谢物），其在部分训练集、CRA子集、CRC子集中AUROC值为0.995，0.912、0.994，进行10倍交叉验证（图8 H、I），表明该复合检测组可以用于对CRC的诊断。
图8 基于CRC血清代谢物组的预测模型
研究结论
1.本研究共招募225名受试者，其中健康组(n=91)、结直肠腺瘤组(n=63)和结肠直肠癌组(n=71)；
2.结合宏基因组学和代谢组学分析，鉴定出结直肠癌（CRC）的肠道微生物和血清代谢组的变化；
3.对肠道微生物和代谢组进行联合分析，并建立了基于菌群和血清代谢物的诊断模型（12种微生物+3种代谢物），诊断效果良好；
4.该研究表明，CRC中的微生物和代谢的转变可能具有广泛的人群相关性，这些发现对于CRC的诊断以及疾病机理和治疗靶点的研究，具有重要参考价值。
