英文标题：Pyruvate metabolism enzyme DLAT promotes tumorigenesis by suppressing leucine catabolism
中文标题：丙酮酸代谢酶 DLAT 通过抑制亮氨酸分解代谢促进肿瘤发生
发表期刊：Cell Metabolism
影响因子：30.9
肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）在全球范围内的发病率和死亡率呈显著上升趋势，代谢重编程在其进展过程中扮演着关键角色，主要体现为 Warburg 效应以及支链氨基酸（BCAA）代谢的异常改变。丙酮酸作为 Warburg 效应的重要中间产物，其代谢与肿瘤发生密切相关，而丙酮酸脱氢酶（PDH）复合体是连接糖酵解与三羧酸循环（TCA 循环）的关键桥梁，其中二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶（DLAT）作为 PDH 复合体的核心组分，不仅在丙酮酸代谢中通过乙酰基转移参与乙酰辅酶 A 的生成，还被发现可作为蛋白质乙酰转移酶修饰其他分子，但它在协调其他代谢通路促进肿瘤生长方面的作用尚未明确。
在支链氨基酸代谢中，亮氨酸是激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体 1（mTORC1）通路的关键调控因子，它能增强 Rag GTPases 与 Raptor 的结合，从而激活 mTORC1，维持蛋白质合成信号，推动癌细胞快速生长，且肝癌组织中亮氨酸水平升高与 HCC 进展显著相关。AU RNA 结合甲基戊二酰辅酶 A 水合酶（AUH）是亮氨酸分解代谢中的关键酶，负责催化生成 S-3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A（HMG-CoA），但其代谢活性的调控机制及其在肿瘤进展中的具体作用仍有待深入探究。
鉴于此，本研究旨在探究 DLAT 是否通过调控亮氨酸代谢参与 HCC 的发生发展，以期揭示 HCC 进展的新机制并为其治疗提供新靶点。
研究者发现丙酮酸代谢中的 DLAT 与 HCC 有着紧密的关联：① DLAT 在 HCC 中显著高表达（图 1B-D），且其高表达与患者总生存期缩短、疾病特异性生存期和无进展间隔降低密切相关。此外， DLAT 也是 HCC 的独立风险因素；② DLAT 在恶性细胞中显著高表达，且其表达水平与恶性细胞比例呈显著正相关（图 1E-G）；③ HCC 样本中 DLAT 表达升高（图 1I-L）；同样地，DEN 诱导模型中也发现 DLAT 的高表达（图 1M-N）；④ DLAT 亦可作为 HCC 的潜在诊断生物标志物。综上，DLAT 不仅在 HCC 进展中发挥关键作用，其表达水平还可作为预后评估和早期诊断的潜在靶点。
图1. 肝细胞癌中 DLAT 高表达与不良预后相关
基于上述结果，研究者推导并验证了 DLAT 的表达与癌细胞增殖密切相关：
体外实验：DLAT 沉默会导致 Huh7 和 HepG2 细胞增殖受到显著抑制（图 2A-C）。在构建的 DLAT 敲除稳定细胞系中，HepG2-sgDLAT 细胞的生长速率显著低于对照组，CCK8 分析结果也与此一致（图 2C）。
皮下异种移植模型：为验证 DLAT 对肝癌进展的作用，采用皮下异种移植模型。结果显示，sgDLAT 组肿瘤生长速率、体积和重量显著低于对照组（图 2D-F），且不影响小鼠体重。后续实验进一步确认 MHCC-97H-sgDLAT 肿瘤中 DLAT 被高效敲除（图 2G-H）；Ki-67 染色结果也表明，DLAT 缺失会抑制 HCC 增殖（图 2H-I）。
AAV-DIO-shDLAT 和 MYC/Trp53⁻/⁻肝癌模型：为深入研究 DLAT 在肝癌发展中的关键作用，研究者构建了 AAV-DIO-shDLAT 和 MYC/Trp53⁻/⁻肝癌模型（图 2J）。结果显示，AAV-DIO-shDLAT 组在 MYC/Trp53⁻/⁻注射 21 天后，肿瘤可见性显著降低（图 2K）；30 天后，肝脏肿瘤数量和最大肿瘤体积均显著减少（图 2L-N），且肝脏重量无显著变化，同时证实 DLAT 被高效沉默（图 2O-Q）。此外，在 HCC 样本中，AAV-DIO-shDLAT 组的 Ki-67 表达显著降低（图 2P, R）。
其他模型验证：在 DEN/CCl₄ 模型和 DEN 诱导模型中，也观察到类似结果，即 DLAT 敲低显著减少肿瘤进展和 Ki-67 表达。
综上，DLAT 在体外和体内均是肝癌增殖和进展的关键驱动因子。
图2. 靶向 DLAT 可抑制体外和体内的肿瘤增殖
对 Huh7-sgDLAT 细胞及对照细胞的代谢组学分析显示，DLAT 缺失仅使细胞内琥珀酸总量下降，对柠檬酸、顺乌头酸等其他 TCA 循环中间产物无显著影响（图 3A）。代谢通量分析证实，DLAT 缺失会降低丙酮酸来源的乙酰辅酶 A 及 TCA 中间产物水平，但谷氨酰胺可通过分解代谢补偿这一影响 ——DLAT 缺失显著增加谷氨酰胺来源的α-酮戊二酸、顺乌头酸等 TCA 中间产物，维持循环稳定性。
代谢组学深度分析发现，Huh7-sgDLAT 细胞中亮氨酸、天冬氨酸、缬氨酸水平显著下调（图 3A-B），质谱分析进一步验证了这一结果（图 3E）。功能实验显示，仅补充亮氨酸可逆转 DLAT 缺失导致的细胞生长抑制（图 3C-D），且亮氨酸水平与 DLAT mRNA 表达呈显著正相关（图 3F）。
机制上，DLAT 缺失对 BCAA 相关氨基酸转运体的表达及功能无显著影响（图 3G-H），但代谢通量分析表明其可促进亮氨酸分解代谢 ——sgDLAT 组中源自亮氨酸的 HMG-CoA 和乙酰辅酶 A 水平升高，而上游代谢物 KIC 比例不变，提示 DLAT 不参与亮氨酸转氨反应（图 3I-L）。此外，BCAA 分解代谢上调与 HCC 患者更长的总生存期和无病间期相关（图 3M-N），证实亮氨酸分解代谢在 DLAT 介导的 HCC 进展中起核心作用。
综上，DLAT 缺失对 TCA 循环的直接影响有限，主要通过调控亮氨酸分解代谢影响 HCC 进展。
图3. 靶向 DLAT 可促进肝细胞癌中的亮氨酸分解代谢
为阐明 DLAT 调控 HCC 发展的分子与代谢机制，结合 RNA-seq 与 GSEA 分析，发现 mTOR 信号通路在 DLAT 高表达组显著富集（图4A-D），且 DLAT 表达与 mTOR 信号呈正相关。同时，DLAT 缺失也显著抑制 mTOR、S6K 和 S6 的磷酸化 （图4E-F），表明 mTOR 信号被阻断。此外，亮氨酸补充能够逆转 DLAT 缺失导致的 mTORC1抑制（图4G），且恢复 Rag GTP 酶与 Raptor 的相互作用（图 4H），证实 DLAT 通过亮氨酸调控 mTOR 信号。另一方面，随着亮氨酸补充， DLAT 缺失对 HCC 细胞增殖的抑制也显著减弱（图4I-J）。同样地，氨基酸信号通路（调控 mTOR 激活）亦与 HCC 患者不良预后相关（图 4K-L），这些结果都指向着 mTOR 信号异常与 HCC 进展密切相关。综上， DLAT 缺失通过降低亮氨酸水平抑制 mTOR 信号，从而抑制 HCC 的增殖与进展。
图4. DLAT 缺失通过抑制亮氨酸 - mTOR 信号通路抑制肝细胞癌增殖
为阐明背后潜在的分子机制，研究者先是发现了 DLAT 的缺失对关键亮氨酸分解代谢酶的蛋白水平影响较小，随后推测出可能是翻译后的修饰调控所致，即 DLAT 可能通过调控这些分解代谢酶的乙酰化水平来影响亮氨酸代谢。综合乙酰化组深度分析（图 5A-B）和 KEGG 富集（图 5C）的结果， DLAT 很有可能调控亮氨酸分解代谢酶的乙酰化。
由于亮氨酸代谢酶多定位于线粒体，研究者便在全局线粒体乙酰化水平分析中，发现 DLAT 的缺失显著降低了部分蛋白的乙酰化水平，随后鉴定出 47 个与 DLAT 互作的蛋白（图 5D）。结合乙酰化组学结果以及 BCAA 代谢相关酶数据集，三者交集的 AUH，一种亮氨酸分解代谢酶，被确定为DLAT的潜在乙酰化靶点（图 5D）。
后经验证，DLAT 的过表达确实显著增强了 AUH 乙酰化（图 5E），而 DLAT 敲除则相反（图 5F）；体外乙酰化实验亦证实 DLAT 直接乙酰化 AUH（图 5G）。联合酶学特性分析，DLAT 对 AUH 的 Km 值为 0.6753 mM（图 5H），表明高底物亲和力；反应动力学显示负协同效应（Hill 系数≈0.7462）和浓度依赖性（图 5I）。
此外，DLAT 与 AUH 在线粒体中共定位（图 5J）；免疫印迹及 coIP 的结果都确认两者的直接互作关系（图 5K-M）；而当 C 端内域（DI）缺失时互作会被破坏，表明 C 端区域对互作至关重要。
综上，DLAT 直接与 AUH 互作并调控其乙酰化水平。
图5. DLAT 作为亮氨酸分解代谢酶 AUH 的乙酰转移酶发挥作用
在 Huh7-sgDLAT 细胞中，其生长速率显著低于对照组（图 6A），而此却能够通过 AUH 敲低逆转其细胞生长抑制（图 6A）。而在 EdU 染色实验中，亦观察到类似结果，即 AUH 敲低缓解了 DLAT 缺失对 HCC 细胞增殖的抑制作用（图 6B-C）。此外，AUH 敲低也减弱 DLAT 缺失后亮氨酸水平的下降（图 6D），表明 DLAT 依赖 AUH 调控亮氨酸代谢。
为探索背后调控机制，结合乙酰化组学数据（图 5A），鉴定出 AUH 的三个潜在乙酰化位点：K109、K160 和 K211（图 6E）。而其中的 K109 被成功验证，其应是此调控网络中关键位点（图 6E-G），同时此位点在物种间高度保守（图 6H）。
将 K109 位点突变，命名为 AUHK109R，在酶活性验证中，能够发现突变体的催化活性显著高于野生型，证实 K109 乙酰化抑制 AUH 功能（图 6I）。此外，AUHK109R 过表达还会抑制 mTOR 的激活（图 6J），EdU 染色也显示其增殖抑制（图 6K-L）。
综上， DLAT 直接乙酰化 AUH 的 K109 位点，抑制其催化活性，从而促进 HCC 增殖。
图6. DLAT 通过 K109 位点乙酰化抑制 AUH 活性
基于上述研究，研究者构建了脂质纳米颗粒（LNP）封装的 AUHK109R 突变体 mRNA 作为新的治疗方案。结果显示，此方案能够显著抑制 MHCC-97H 异种移植瘤的生长 ，其肿瘤体积（图 7A-B）和重量（图 7C-D）均显著降低，且各组小鼠体重无显著差异，同时对肿瘤增殖和干细胞特性也表现出抑制作用（图 7E-G）。
检测皮下移植瘤中的亮氨酸水平，发现颗粒治疗组中的亮氨酸水平显著降低（图 7H），推测 AUH 功能异常可能与亮氨酸代谢紊乱相关。另外，该组中 mTOR 激活被显著抑制（图 7I）。
在治疗作用方面，与对照组相比，治疗组的肿瘤体积和重量显著降低（图 7K），Ki-67 和 EpCAM 表达水平（图 7L-N）和 mTOR 磷酸化水平也都显著下降（图 7O），但三组小鼠体重无显著差异。在安全性评估方面，该方案在 BALB/c 裸鼠中，对正常组织无明显毒性。
综上所述，该方案能够显著抑制 HCC 肿瘤的生长，且在体内具有良好的安全性，为 HCC 治疗提供了新的策略。
图7. 脂质纳米颗粒包装的 AUH 突变体 mRNA 有效抑制体内肿瘤异种移植物的生长
本研究聚焦丙酮酸代谢酶 DLAT 在 HCC 中的作用及机制，发现 DLAT 在 HCC 中高表达且与患者不良预后密切相关。其通过直接乙酰化亮氨酸分解代谢酶 AUH 的 K109 位点，抑制 AUH 活性，导致亮氨酸积累并持续激活 mTORC1 信号通路，从而促进肿瘤增殖。基于此，研究团队开发的 AUHK109R-mRNA 脂质纳米粒（LNP）治疗策略，可有效恢复亮氨酸分解代谢、抑制 mTOR 激活，在体内显著抑制 HCC 生长且安全性良好，为 HCC 治疗提供了新靶点和潜在治疗方案。
