发表期刊： Journal of Translational Medicine
影响因子：7.4
合作单位：山西医科大学
百趣提供服务：新一代代谢组学NGM
手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)是由多种肠道病毒感染引起的，对儿童构成验证的公共卫生威胁。肠道病毒71(Enterovirus 71, EV71)是手足口病的主要病原体，属于一种肠道病毒。目前手足口病尚无特效药物，仅能通过饮食或饮食成分得到缓解。黄芪通过健肺脾来预防病毒入侵，黄芪皂苷 IV(Astragaloside IV, AST-IV)是黄芪的一种有效活性成分，研究表明AST-IV可抑制多种病毒的复制；然而，AST-IV对EV71病毒复制的抑制作用及其机制尚不完全清楚。本研究采用体外EV71感染和抗EV71病毒治疗模型，探讨AST-IV抗EV71病毒的作用机制。
1. AST-IV抑制EV71复制
为研究AST-IV对EV71复制的影响，研究者利用AST-IV处理GSE-1细胞，再用EV71感染，结果表明AST-IV对细胞活力无影响，但提高了被EV71感染的细胞活力（图1B-C）。此外，AST-IV处理降低了EV71感染的GES-1细胞的VP1蛋白水平和病毒滴度（图1D-F），这表明病毒复制降低。综上所述，AST-IV能有效抑制EV71的复制。
图1. AST-IV抑制EV71复制
2. AST-IV对EV71诱导细胞凋亡的影响
采用碘化甲基(propyl iodide, PI)染色和免疫印迹法(Western blot, WB)研究AST-IV对EV71诱导的细胞凋亡的保护作用。结果表明，EV71感染显著增加了PI阳性细胞的数量，但AST-IV治疗降低了阳性细胞数量，这表明AST-IV对EV71诱导的细胞毒性具有保护作用（图2A-B）。此外，裂解的PARP和caspase-3水平在EV71感染的GES-1细胞中显著增加，而AST-IV抑制了PARP和caspase-3蛋白的降解，这表明EV71感染激活细胞凋亡，AST-IV对EV71诱导的细胞凋亡具有保护作用（图2C-E）。综上所述，AST-IV对EV71诱导的GES-1细胞凋亡具有保护作用。
图2. AST-IV对EV71诱导细胞凋亡的影响
3. EV71感染和AST-IV处理的GES-1细胞代谢谱分析
作者利用代谢组学研究AST-IV是如何通过调节代谢物来发挥其对抗EV71病毒的复制机制。首先PCA和OPLS-DA显示对照组、EV71组、AST-IV组和EV71_AST-IV组的样本明显分离（图3）。火山图显示对照组与EV71组、对照组与AST-IV组和EV71组与AST-IV分别有293、196和302个差异代谢物（图4A-C）。韦恩图显示三组共有114种差异代谢物（图4D）。其中次黄嘌呤、2-酮丁酸、腺嘌呤等8种代谢物在AST-IV处理的GES-1细胞中显著改变（图5A-H）。经AST-IV处理后，这些代谢物在感染EV71的细胞中发生回调（代谢物的水平恢复到与对照组基本相同的水平）。AST-IV对核苷酸代谢、细胞能量产生和柠檬酸循环、细胞生长激素代谢、脂肪酸代谢、磷脂代谢有影响。综上所述，这些代谢物可能作为AST-IV抑制EV71感染的潜在靶点。
图3. PCA和OPLS-DA模型得分图
图4. 火山图和韦恩图分析四组不同代谢产物
图5. AST-IV调节的与EV71感染相关的GES-1细胞指标的相对峰值区域
4. AST-IV对抗氧化活性的影响
为了研究氧化应激与病毒复制之间的关系，作者检测了活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平和氧化应激生物标志物。结果显示AST-IV处理降低了EV71感染的GES-1细胞或RD细胞的ROS水平，增加了过氧化氢酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)的活性，同时降低了丙二醛(malondialdehyde, MDA)水平（图6A-G）。结果表明，AST-IV可有效保护GES-1细胞和RD细胞免受EV71诱导的氧化损伤。同时，研究者发现ROS抑制剂-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine, NAC)降低了EV71感染的GES-1细胞上清液中的VP1蛋白水平和病毒滴度（图6H-J），这表明AST-IV和NAC都可能通过减少氧化应激来抑制EV71的复制。因此AST-IV通过抑制EV71诱导的氧化应激发挥抗EV71的作用。
图6. AST-IV对抗氧化活性的影响
5. AST-IV和手足口病的靶点
利用网络药理学分析来探讨AST-IV治疗手足口病的机制。从OMIM数据库、DisGenet数据库和GeneCards数据库分别收集了535个、63个、1470个靶点。同时根据高通量基因表达数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)中RNA序列(GSE15323)筛选了312个差异基因(Differential Expression Analysis, DEGs)，最终鉴定出2223个与手足口病相关的治疗靶点（图7A）。同时收集了AST-IV的100个治疗靶点（来自Swiss TargetPrediction database和TargetNet数据库）（图7B）。AST-IV和手足口病有44个共同靶点（图7D）。
图7. AST-IV和手足口病的靶点
6. 网络构建与分析
利用Cytoscape构建44个共同靶点的PPI网络，根据度值排名筛选前10位的枢纽基因，同时使用cytoHubba插件筛选了排名前10位的枢纽基因。最终鉴定了6个常见的枢纽基因（图8A-B），分别是AKT1、SRC、STAT3、EGFR、HSP90AA1和MDM2，并构建了PPI网络（图8C）。GO富集表明AST-IV对EV71复制的抑制与药物应答、细胞对外部刺激的应答、脂质代谢过程的调节、活性氧生物合成过程的调节等有关（图8D）。KEGG富集分析显示，枢纽基因主要富集于PI3K- AKT信号通路、cAMP信号通路以及脂质和动脉粥样硬化信号通路(图8E)。使用metscape进行KEGG分析，关键靶点与PI3K-AKT通路密切相关（图8F）。
图8. 网络构建与分析
7. AST-IV对EV71感染GES-1细胞中PI3K-AKT通路的影响
利用WB和分子对接技术研究AST-IV对EV71感染GSE-1细胞中PI3K-AKT通路的影响。作者发现EV71感染组的p-PI3K和p-AKT水平呈剂量依赖性降低，而AST-IV处理组的p-PI3K和p-AKT水平升高，同时AST-IV 治疗逆转了对 PI3K-AKT信号通路的抑制作用（图9A-I），这表明AST-IV抵消了EV71对GES-1细胞中PI3K-AKT通路的负面影响。分子对接法表明AST-IV与AKT1和PIK3R1蛋白之间有良好的键合。综上所述，AST-IV治疗可激活PI3K-AKT通路，并逆转EV71感染对GES-1细胞的抑制作用。
图9. AST-IV对EV71感染和AST-IV处理的GES-1细胞PI3K-AKT通路的影响
8. 代谢物与表观指标之间的关系
采用相关性分析探讨代谢物对氧化应激、PI3K-AKT信号传导、细胞凋亡和EV71病毒复制的影响（图10），发现次黄嘌呤、2-酮丁酸、烟酸单核苷酸、前列腺素H2等与ROS、MDA、细胞凋亡和VP1蛋白水平呈负相关，与PI3K-AKT信号通路、T-AOC、GSH-Px、CAT呈正相关。综上所述，AST-IV可能通过与次黄嘌呤、2-酮丁酸等8种关键代谢物相互作用，促进PI3K-AKT信号传导，从而抑制EV71的复制，最终引发抗氧化应激反应。
图10. 目标代谢物与表观指标的相关性
通过组学研究和验证实验，作者发现AST-IV可通过次黄嘌呤、2-酮丁酸和腺嘌呤等8种代谢物激活cAMP和抗氧化应激反应，进一步刺激PI3K-AKT信号传导，从而抑制EV71诱导的细胞凋亡和 EV71复制。接下来，作者将确定AST-IV与PI3K和AKT的靶向结合位点，并在动物模型和临床试验中验证这些发现，以此来评估AST-IV治疗EV71感染的转化潜力，为治疗手足口病提供一种可能的治疗方案。
