文章标题：Blockage of glycolysis by targeting PFKFB3 suppresses the development of infantile hemangioma
发表期刊：Journal of Translational Medicine
影响因子：8.44
作者单位：四川大学华西医院
百趣提供服务：中心碳代谢
研究背景
婴儿血管瘤(Infantile Hemangioma, IH)是婴儿最常见的肿瘤，但其确切的发病机制尚不清楚。前期研究发现，糖代谢可能在IH发病机制中发挥重要作用，抑制糖酵解关键酶磷酸果糖激酶-1可抑制IH血管生成。磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-双磷酸酶3 (PFKFB3)是一种将果糖- 6-二磷酸转化为果糖-2,6-二磷酸的代谢酶，是限速酶磷酸果糖激酶-1最有效的变构激活剂。本研究旨在探讨PFKFB3在IH中的作用。
结果与分析
1.PFKFB3在增殖期IH组织与HemEC中高表达
共鉴定出222个差异表达基因(Differentially Expressed Genes, DEGs)（141个上调，81个下调），如下图所示（图1A），PFKFB3是最显著的DEGs之一。DEGs在生物过程中主要富集在 “细胞脂代谢”等过程中（图1B）；在KEGG途径中主要富集在“甘油脂代谢”等通路上（图1C）。在对芯片结果验证过程中，发现PFKFB3蛋白在增殖型IH组织中的表达高于渐开化型消退期IH组织（图1D）。此外，PFKFB3蛋白在血管瘤内皮细胞(Hemangloma-derived endothelial cell, HemEC)中的表达高于人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)（图1E）。
总之，细胞代谢与IH的发展密切相关，PFKFB3在增殖的IH组织和HemECs中高表达，可能在IH发展的调节中发挥重要作用。
图1. PFKFB3在增殖IH组织和HemEC中的过表达
2.PFK15抑制HemEC血管生成
随着药物浓度的增加，PFK15（PFKFB3抑制剂）处理引起HemECs的形态学逐渐改变，包括细胞密度下降、细胞收缩和细胞碎片增加（图2A），PFK15以剂量依赖的方式降低HemECs的活力（图B）。为了进一步验证PFK15在抑制细胞增殖中的作用，在体外评估了PFK15对HemEC体外成管的影响。结果表明，PFK15显著抑制血管生成（图C）。总之，用 PFK15抑制PFKFB3可以降低HemEC血管生成。
图2. PFK15抑制HemEC血管生成
3.PFK15抑制HemEC葡萄糖代谢
对葡萄糖进行靶向代谢组学分析。PCA（图3A）图显示对照组和PFK15处理组之间存在显著差。如火山图（图3B）和热图所示（图3C），共鉴定出45种差异代谢物。PFKFB3被抑制后，许多糖酵解代谢物，包括葡萄糖6-磷酸、果糖6-磷酸和果糖1,6-二磷酸含量仍比对照组更高（图3C）。与对照组相比，PFKFB3被抑制后，属于“TCA循环”的代谢物柠檬酸、异柠檬酸、富马酸、α酮戊二酸、苹果酸和琥珀酸也显著增加（图C）。随后选取差异最高的14种代谢物进行KEGG通路分析。发现这些代谢物主要富集在糖酵解相关途径，如“磷酸戊糖途径”、“糖酵解/糖异生”、“丙酮酸代谢”和“TCA循环”（图3D，E）。综上所述，被PFK15抑制的PFKFB3可以减少HemECs的糖代谢。
图3. PFK15抑制HemEC葡萄糖代谢
4.PFK15抑制HemEC迁移，诱导细胞凋亡
细胞迁移实验结果显示PFK15抑制HemECs的迁移（图4A）。此外，当PFK15联合普萘洛尔(propranolol)治疗时，观察到一种协同抑制作用（图4A）。为了确定PFK15诱导的协同迁移抑制是否是由于细胞凋亡，使用Annexin V和PI标记进行流式细胞术分析。结果显示，PFK15处理组的凋亡细胞数量大于对照组（图4B）。
同样，PFK15和普萘洛尔联合治疗导致HemECs凋亡百分比显著增加（图4B）。此外，通过western blot分析，PFK15和HemECs联合治疗后Bax蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达下调（图4C）。与对照组相比，PFK15处理后观察到明显的线粒体应激反应，包括线粒体基质密度增加，线粒体嵴塌陷，线粒体肿胀和线粒体空泡变性（图4D）。线粒体应激反应可大大增加活性氧的产生，导致线粒体凋亡通路的激活。结果显示，与对照组和普萘洛尔组相比，PFK15治疗后ROS生成增加（图4E，F）。
图4. PFK15抑制HemEC迁移并诱导细胞凋亡
5.shPFKFB3抑制HemEC血管生成
为了进一步研究PFKFB3水平是否影响血管生成活性，我们构建了靶向PFKFB3的慢病毒载体shRNA（图5A）。转染shPFKFB3后，PFKFB3在HemECs中的蛋白表达水平显著降低（图5B）。
敲低PFKFB3也显著抑制了HemEC的血管生成（图5C）。shPFKFB3显著抑制了细胞迁移（图5D）。此外，shPFKFB3慢病毒组的凋亡细胞比例高于对照组（图5E）。综上所述，敲除PFKFB3显著抑制了HemEC血管生成。
图5. PFKFB3下调抑制HemEC血管生成并诱导细胞凋亡
6.PFKFB3抑制降低了HemECs中PI3K/Akt信号通路的激活
为了确定PFKFB3被抑制后IH中调控血管生成活性的关键通路，对PFK15处理组和对照组进行了转录分析。共鉴定出1240个DEGs（357个上调，783个下调）。GO分析显示，这些DEGs主要富集在“血管生成”、“细胞粘附”和“凋亡过程的正向调控”等生物过程中（图6A）。KEGG通路分析中显著富集在PI3K-Akt信号通路（图6B）。这些数据表明，PI3K-Akt通路可能参与PFK15治疗后IH血管生成和细胞代谢的调节。此外，对转录和代谢结果进行综合分析的结果显示，“糖酵解或糖异生”是最重要的途径（图6C），表明抑制PFKFB3主要影响HemECs中的糖酵解。
为了进一步证明PI3K-Akt通路在PFKFB3调控中的作用，我们首先使用STRING进行了功能蛋白关联分析，以建立Akt和PFKFB3之间的潜在关系。可以看出，PFKFB与Akt直接相连，Akt也与Bax和Bcl-2密切相关(图6D)。接下来，利用Co-IP验证PFKFB3与Akt之间的蛋白-蛋白相互作用（图6E）。
由于PI3K/Akt信号通路参与了PFKFB3的调控，我们试图确定PFK15是否通过该通路诱导HemEC凋亡。Western Blot结果显示，PFK15降低了PI3K和Akt的磷酸化水平（图6F）。与单独使用每种药物相比，PFK15和普萘洛尔联合使用可进一步降低PI3K/Akt的磷酸化水平（图6G）。此外，用shPFKFB3敲除PFKFB3可显著降低PI3K和Akt的磷酸化水平。因此，通过抑制PFKFB3可抑制PI3K-Akt信号通路，诱导细胞凋亡。
图6. PFKFB3抑制抑制HemECs中PI3K/Akt信号通路的激活
7.抑制PFKFB3可抑制体内IH血管的形成
为了研究我们的体外研究结果是否可以转化为体内环境，我们使用HemECs和血管瘤源性周细胞建立了小鼠异种移植模型（图7A）。14d处死实验动物，解剖实验动物的肿瘤（图7B）。14d后仅PFK15组和联合用药组的肿瘤生长显著降低（图7C）。
HE染色结果显示，PFK15单独或联合普萘洛尔可显著减少微血管数量（图7C）。此外，与对照组相比，PFK15单独使用或联合普萘洛尔可降低CD31基因的表达（图7C）。转导shPFKFB3可减少微血管数量和CD31的表达（图7D），沉默PFKFB3也显著降低了MVD（图7F）。所有这些结果都表明，抑制PFKFB3可以抑制体内IH血管的形成。
图7. 抑制PFKFB3可抑制体内IH血管的形成
结论
总之，这些结果表明抑制PFKFB3可以降低IH血管生成并诱导细胞凋亡，靶向PFKFB3可能是IH的一种新的治疗策略。
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