发表期刊：Food Chemistry
影响因子：9.23
作者单位：扬州大学
百趣提供服务：发现代谢组学Classic-亲水版、600MRM
研究背景
近年来，食品安全问题一直是世界各国广泛关注的问题。鸡肉由于其高蛋白、低脂肪、低热量和低胆固醇的特性，已成为全世界消费者接受的优质蛋白质来源。肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)是一种常见的食源性细菌。据统计，世界上每年感染沙门氏菌的人数达到8000万至9400万，其中5.9万至15.5万人死亡。因此，监测和控制鸡肉中的沙门氏菌污染对于保障消费者的健康和生命安全至关重要。而传统的微生物检测法、免疫学法以及PCR检测技术已不能满足快速高效检测现代食源性病原体的要求，本研究结合非靶向和靶向代谢组学旨在发现鸡肉中肠炎沙门氏菌污染的代谢生物标志物。
实验设计
（1）样本类型：鸡肉组织
（2）发现集（非靶向检测）
分组：0h（对照组，接种沙门氏菌培养0小时，n=10）；6h（接种沙门氏菌培养6小时，n=10）；12h（接种沙门氏菌培养12小时，n=10）；18h（接种沙门氏菌培养18小时，n=10）。
（3）验证集（靶向检测）
污染组（接种沙门氏菌培养18小时，n=10）和对照组（新鲜鸡肉样品，n=10）（图1）。
图1. 实验设计
研究结果
1.鸡肉中肠炎沙门氏菌的非靶代谢谱及差异物筛选
通过非靶向检测，正离子模式(POS)和负离子模式(NEG)分别检测出441和240种代谢产物。并使用多元统计分析对肠炎沙门氏菌污染不同时期的代谢物进行主成分分析(PCA)，结果表明，四组在第一个主成分存在显著分离，且同组实验样本及QC样本聚集性较好，表明系统的稳定性和采集数据的可靠性（如图2E-F）。接下来作者对检测的代谢物进一步进行了差异物质筛选，筛选标准为P<0.05和fc>1.5。结果表明，在正离子模式下筛选了238种差异代谢物，其中157种上调，81种下调。在负离子模式下，筛选了174种差异代谢物，其中57种表达上调，117种表达下调。并通过火山图展示了不同比较组的差异代谢物（图3）。
图2. 主成分分析（E，正离子模式；F，负离子模式）
图3. 火山图分析（A，正离子模式；B，负离子模式）
2.潜在代谢产物生物标志物的鉴定
接下来作者对以上差异物质进行了OPLS回归分析，获得了稳健且具有良好预测效果的模型（图4）。并通过OPLS回归分析得到的PreVIP值（PreVIP>1.5）进一步筛选出30种代谢产物为肠炎沙门氏菌感染的潜在生化标志物（图5AB）。根据HMDB数据库中的二级分类将30种代谢产物分为6类，即有机酸及其衍生物（34.375%）、有机杂环化合物（25%）、脂类和类脂分子（21.875%）、无机氮化合物（12.5%）、核苷，核苷酸及其类似物（3.125%）和有机化合物（3.125%）（图5C）。
图4. OPLS回归模型分析（ACE，正离子模式；BDF，负离子模式）
图5. 鸡肉肠炎沙门氏菌潜在代谢生物标志物的鉴定
3. 潜在代谢产物生物标志物的代谢途径分析
作者使用Metalanalyst5.0对30种潜在生物标志物进行了通路富集分析（图6）。结果表明，30个潜在的生物标志物共富集到21个代谢通路途径，其中6个通路富集显著（P<0.05），包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成途径、脂代谢途径、组氨酸、泛酸盐和CoA生物合成途径、柠檬酸循环（TCA循环）和tRNA生物合成途径。有研究表明，在肉类中，碳水化合物和某些氨基酸是腐败相关代谢产物的前体，另外游离氨基酸可能是细菌的生长促进剂。因此，富集的代谢途径对鸡肉肠炎沙门氏菌污染和恶化至关重要。
图6. 生物标志物的代谢途径富集分析
4.靶向代谢组学分析（验证集）
为了准确识别受肠炎沙门氏菌污染的鸡肉和新鲜鸡肉之间的代谢生物标志物，作者基于非靶向代谢组学筛选出的候选生物标志物，进一步对肠炎沙门氏菌污染的鸡肉和新鲜鸡肉进行了UHPLC-QQQ-MS靶向定量分析。为了反映肠炎沙门氏菌污染的鸡肉和新鲜鸡肉之间的差异，进行了OPLS-DA建模分析，并使用7倍交叉验证验证了模型质量。结果表明肠炎沙门氏菌污染的鸡肉和新鲜鸡肉间存在较大代谢差异，且OPLS-DA模型是稳健的，没有过度拟合（图7）。另外通过P＜0.05和VIP＞1筛选出其中5种代谢物作为鸡肉中肠炎沙门氏菌污染的生物标志物，包括乙酰胆碱、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-缬氨酸和L-正亮氨酸，且这5种代谢物在非靶代谢谱结果中也是潜在差异物。接着对这5种代谢物进行欧氏距离矩阵分析法对差异代谢物进行聚类，结果如图所示，5种代谢物在不同组间聚集明显（图7A）。同时，箱型图结果表明，5种代谢物组间显著差异，且在污染组都呈现显著的上调趋势（图8B），作者推测这5种代谢物可能是检测鸡肉中肠炎沙门氏菌污染的潜在生物标志物。
图7. 靶标代谢组学OPLS-DA分析
图8. 5种生物标志物的层次聚类和箱型图分析
5.代谢产物生物标志物的ROC分析
ROC曲线用于评估5种代谢产物生物标志物的辨别能力。当AUC值在0.5-0.7时，AUC具有较低的准确性；AUC值在0.7-0.9，AUC具有良好的准确性；如果AUC值高于0.9，则AUC具有较高的准确性。结果如图所示，5种代谢物单独及联合的AUC值均高于0.9（图9），表明这5种生物标志物在预测鸡肉中肠炎沙门氏菌污染方面具有很高的准确性。
图9. 5种生物标志物的ROC曲线分析
研究结论
本研究通过整合非靶向和靶向的代谢组学分析来鉴定鸡肉中肠炎沙门氏菌污染的代谢生物标志物。30种不同的代谢物被鉴定为候选代谢生物标志物。通过基于UHPLC-QQQ-MS的靶标代谢组学，乙酰胆碱、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-缬氨酸和L-正亮氨酸被确认为鸡肉中肠炎沙门氏菌的代谢生物标志物。在肠炎沙门氏菌污染的鸡肉中，5种代谢生物标志物的丰度均显著上调。总之，本研究的发现将促进快速准确地检测鸡肉中肠炎沙门氏菌新方法的发展。
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