标题：Isolation and characterization of Pseudomonas fluorescens producing biogenic amines: AHL-mediated quorum sensing as a key regulatory mechanism
发表期刊：LWT-Food Science and Technology
影响因子：7.1
合作单位：青岛农业大学
百趣提供的服务：新一代代谢组学NGM 2 Pro、原核转录组测序
研究背景
水产品极易受到荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的污染，其产生的生物胺(biogenic amines, BAs)对食品安全和人类健康构成严重威胁。荧光假单胞菌的群体感应(quorum sensing, QS)功能是通过N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl homoserine lactones, AHLs)来调控其腐败特性。鉴于BAs是腐败严重程度的重要指标，推测QS系统也可能对荧光假单胞菌产生BAs起调节作用，而且目前尚无系统研究证实AHLs介导的群体感应系统对荧光假单胞菌生物胺合成的调控机制。因此本研究旨在通过筛选产BAs的荧光假单胞菌菌株、构建AHLs合成酶基因敲除菌株，以及分析群体感应调控下的生物胺产量，来验证这一假设。
研究结论
01.产BAs荧光假单胞菌的筛选与鉴定
从变质鲑鱼鱼片中分离出20株细菌，在显色培养基上均能产生碱性物质（图1A）。其中6株菌能使氨基酸脱羧酶培养基发生颜色变化，证实它们具有合成BAs的能力（图1B）。通过16S rRNA测序及系统发育分析，确认这些菌株均为荧光假单胞菌（图1C-D）。
图1.产BAs荧光假单胞菌luxI基因敲除菌株的筛选、鉴定和构建
02.luxI基因敲除菌株的构建
在这6株荧光假单胞菌菌株中，PF12菌株的生物胺产量最高（图1E），因此被选用于luxI基因的敲除实验。通过同源重组技术成功替换了luxI基因，这一结果经PCR验证确认（图1F–I）。该敲除菌株(ΔluxI)丧失了AHL的合成能力，但在LB培养基中仍能存活。
03.LB培养基中不同处理组细菌BAs、AHLs、菌落总数和QS表型的差异
荧光假单胞菌PF12的总生物胺含量随时间推移逐渐升高，24h时检测到组胺，48h时出现腐胺（图2A），添加外源性C6-HSL、C8-HSL和C10-HSL后，组胺含量均显著提高，其中C8-HSL对腐胺的影响最大。野生型荧光假单胞菌PF12产生四种类型的AHL：C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL和C14-HSL，24h时，C8-HSL的产量最高（图2B），ΔluxI菌株不产生AHLs，且C14-HSL在随后的培养阶段变得检测不到，可能在LB中降解。图2C显示，所有处理组的菌落数均随时间下降且均表现出相似的生长模式，表明luxI基因缺失或外源添加AHL均不显著影响细菌生长。QS相关表型，包括运动性、铁载体产生、蛋白酶活性和生物膜形成，在ΔluxI中显著受损，但被外源性AHL拯救，其中C8-HSL的提高幅度最大（图3A-D）。扫描电镜显示ΔluxI细胞呈分散状态，EPS减少，在敲除菌株和野生型菌株中加入外源性AHL后，细胞聚集成簇，形成厚而致密的生物膜，细菌包裹在EPS中，形成复杂的三维结构（图3E）。激光共聚焦扫描显微镜证实，AHLs处理可显著增加两株菌的生物膜厚度与总量（图3F）。定量分析显示，AHLs可促进生物膜形成，其中C8-HSL促生效果最显著，其余AHLs促生效果依次递减（图3G）。拉曼光谱分析结果显示，胞外聚合物(EPS)的主要成分包括蛋白质、碳水化合物、核酸及脂质。添加群体感应信号分子AHLs后，菌株分泌的EPS在种类与含量上均显著增加。拉曼光谱特征峰强度的降低证实，ΔluxI基因缺失株的EPS含量较野生型菌株显著减少；而添加AHLs后，该缺失株的EPS含量则出现回升（图3H）。
图2.在添加氨基酸的LB中，不同类型的外源AHLs对荧光假单胞菌PF12和ΔluxI的BAs产生、信号分子和细菌生长曲线的影响
图3.外源添加不同AHLs对荧光假单胞菌PF12和ΔluxI在添加氨基酸的LB中QS表型的影响
04.冷藏鲑鱼中不同处理组细菌中FAA、氨基酸脱羧酶、BA和AHLs的差异
鲑鱼片中检出17种游离氨基酸(FAA)，赖氨酸含量最高。总FAA随储存先升后降，酪氨酸等BAs前体氨基酸含量逐渐减少。接种荧光假单胞菌PF12可提高FAA水平，添加C8-HSL后效果更显著，ΔluxI突变株组FAA低于野生型，外补C8-HSL可回升。如图4A所示，PF12产BAs随储存延长而增多，144h时野生型总BAs达224.64 mg/L，C8-HSL可使其提升89.68%；ΔluxI突变株BA产量降低，外添AHLs可部分恢复，信号分子影响强度为C8-HSL＞C6-HSL＞C10-HSL＞C14-HSL＞CM-HSL。图4B显示，接种PF12的鲑鱼片24小时检出多种AHLs，C8-HSL可显著提升其含量，ΔluxI突变株AHLs水平显著低于野生型。图4C表明，储存期脱羧酶活性上升，精氨酸、鸟氨酸脱羧酶活性最高，C8-HSL可增强后者活性。生长曲线（图4D）显示各组细菌增殖趋势一致，突变及外添AHLs对其生长无显著影响。
图4.不同类型的AHLs对冷藏鲑鱼片中BAs的类型和产量、信号分子、氨基酸脱羧酶活性以及荧光假单胞菌PF12和ΔluxI的细菌生长曲线的影响
05.转录组与代谢组分析
对不同处理的荧光假单胞菌PF12 ΔluxI突变株开展差异表达基因(DEGs)分析，发现敲除luxI仅引发少量基因表达变化，而外源添加C8-HSL、CM-HSL均显著调控菌株基因表达，且ΔluxI突变株的基因表达变化幅度更显著。GO富集分析显示，luxI敲除及群体感应信号分子处理主要影响菌株铁离子稳态与转运、氨基酸分解代谢、转录调控等功能通路；KEGG通路分析进一步表明，差异基因主要富集于卟啉代谢、多种氨基酸的合成与分解代谢通路，C8-HSL处理ΔluxI突变株还可调控其鞭毛组装、生物膜形成等通路。选取pstA、polA等5个基因进行RT-qPCR验证，结果证实C8-HSL处理可显著上调与BAs合成相关的基因表达，与转录组测序结果高度一致（图5）。
PCA分析显示，95%置信区间内所有处理组聚类分离明显（图6A）。KEGG富集分析表明（图6B）：敲除荧光假单胞菌PF12的luxI基因，显著改变支链氨基酸相关代谢通路；野生型PF12添加C8-HSL，上调酪氨酸、丙氨酸等代谢通路，抑制甘氨酸及支链氨基酸相关通路；野生型PF12添加CM-HSL，上调精氨酸、半胱氨酸等代谢通路，下调支链氨基酸合成及赖氨酸降解通路；ΔluxI突变株添加C8-HSL，上调组氨酸代谢，抑制精氨酸合成、酪氨酸代谢；添加CM-HSL则恢复甘氨酸、精氨酸相关通路，降低赖氨酸降解及芳香族氨基酸合成。树状图分析（图7C）进一步显示，luxI敲除主要影响氨基糖/核苷酸糖、β-丙氨酸代谢；而C8-HSL、CM-HSL 处理，均会激活新生霉素合成及酪氨酸、丙氨酸相关代谢通路。
图5.不同处理组菌株的转录组分析结果
图6. 不同处理组菌株代谢组学检测结果
研究总结
综上，AHLs作为群体感应信号分子，介导QS系统调控荧光假单胞菌的生物膜形成、胞外多糖合成、运动能力、铁载体合成等多种致腐特性；同时还可通过调控胞外蛋白酶的分泌及氨基酸代谢通路，影响生物胺的合成。本研究结果为解析水产品中生物胺生成及细菌致腐的分子机制提供了新的见解，证实AHLs是调控生物胺合成的核心因子，也为研发水产品防腐保鲜新策略奠定了理论基础。其中，利用群体感应淬灭剂或抑制剂阻断QS信号通路，减少生物胺生成、延长水产品货架期，是一种极具潜力的技术手段，可作为传统保鲜方法的环保、高效替代方案，满足当下对可持续食品安全技术的需求。
