标题：A commensal protozoan exacerbates acetaminophen-induced liver injury by producing free sphingosine
发表期刊：Gut Microbes
影响因子：15.3
客户单位：徐州医科大学
百趣提供服务：非靶标代谢流
研究背景
肠道微生物群调控宿主疾病转归的相关机制目前尚不明确。作为微生物群落中不可或缺却长期被忽视的类群，肠道共生原生生物对宿主生理与病理进程的作用更是知之甚少。本研究证实，原生生物小鼠三毛滴虫(T. mu)可通过生成游离鞘氨醇，远距离提升宿主对药物性肝损伤的易感性。本研究结果不仅深化了对肠道微生物（尤其是长期被低估的肠道原生生物）如何经肠道-远端器官轴调控肠外疾病转归的认知，同时也初步揭示了肠道共生原生生物特有的代谢通路，相关研究领域仍存在大量待挖掘的内容。
研究概述
研究结果
01.T.mu可加剧宿主由对乙酰氨基酚诱导的肝损伤
对小鼠回输纯化的T. mu虫体后，给予对乙酰氨基酚(APAP)造模处理（图 1A-B）。血清肝功能指标与组织病理学检测结果均证实，经APAP处理后，定植T. mu的小鼠肝损伤程度显著加重（图1C–F）。与之相符，在致死剂量APAP刺激下，T. mu定植小鼠的生存率明显下降（图1G）。T. mu定植可大幅重塑肠道细菌群落（图1H-I）：一方面降低毛螺菌科等潜在保护性菌群丰度，另一方面上调杜氏菌属等有害菌群的占比。但通过抗生素清除小鼠体内革兰氏阳性及革兰氏阴性细菌后，T. mu介导的APAP诱导肝损伤(AILI)加重效应并未得到缓解（图1J–M）。与之对应，采用甲硝唑清除T. mu后，这种肝损伤加剧的表型完全消失（图1J、1N–P）。综上，尽管T. mu能够改变肠道细菌群落组成，但T. mu本身即可直接加重AILI。
图1.T. mu定植会加重宿主AILI的严重程度
02.T.mu可促使宿主肠道内游离鞘氨醇与胆碱大量蓄积
除肠道菌群本身外，肠道代谢物组成可经肠-肝轴关键调控肝脏应答反应。非靶标代谢组学分析显示，T. mu定植会大幅重塑肠道代谢组（图2A）。在所有发生变化的代谢物中，正离子模式下游离鞘氨醇的上调幅度最为显著（图2B-C）。受该结果启发，开展体外细胞实验，证实鞘氨醇可呈剂量依赖性加重APAP诱导的肝细胞死亡（图2D-E），提示其为潜在损伤介导分子。除此之外，游离胆碱水平同样显著升高（图2B、2F）。本团队前期已证实：T. mu来源的胆碱可通过胆碱-三甲胺(TMA)-氧化三甲胺(TMAO)轴扰乱宿主代谢，且TMAO能够激活多条损伤通路。高浓度TMAO同样可加剧对APAP诱导的肝细胞死亡（图2G-H），说明胆碱代谢通路是另一套加重肝损伤的潜在途径。与之结果一致，基于流式细胞术的活/死细胞染色检测，以及对PERK-CHOP、ASK1-JNK两条信号通路活化水平的检测（二者是介导APAP肝细胞坏死的核心级联通路）进一步佐证：鞘氨醇与胆碱衍生代谢物TMAO均可加重APAP诱导的肝细胞损伤（图2I-J）。
图2.T. mu定植可升高肠道鞘氨醇与胆碱水平
03.T.mu通过鞘氨醇-SPHK1/2-S1P-S1PR信号轴加剧对乙酰氨基酚诱导肝损伤
研究发现，T. mu定植会使盲肠内容物中鞘氨醇水平呈时间依赖性升高，同时血清ALT/AST活性的同步上升，肝组织内1-磷酸鞘氨醇(S1P)含量也显著上调（图3A）。使用FTY720拮抗S1P受体(S1PR)后，T. mu加重AILI的效应完全消失（图3B–F）。与之结果一致，体外细胞实验中FTY720可逆转鞘氨醇诱导的APAP肝细胞损伤加剧现象（图3G-H）。此外，通过抑制鞘氨醇激酶1/2(SPHK1/2)阻断鞘氨醇转化为S1P，同样能够消除T. mu的促肝损伤作用（图3B-C、I–N）。值得注意的是，SPHK1与SPHK2在T. mu加重AILI过程中发挥同等重要作用：单独抑制SPHK1或SPHK2任一亚型，即可完全阻断T. mu介导的AILI加剧效应（图3I–N）。
图3.T. mu经鞘氨醇-SPHK1/2-S1P-S1PR信号轴加剧AILI
04.T.mu生成游离鞘氨醇
鞘氨醇可通过棕榈酰辅酶A从头合成，也可来源于膳食鞘脂类物质。为验证T. mu能否直接生成游离鞘氨醇，本研究采用全碳¹³C标记棕榈酸开展体外¹³C同位素示踪分析。出乎意料的是，实验仅检测到双¹³C标记的鞘氨醇，并未出现棕榈酸完整掺入后应生成的十六个¹³C全标记鞘氨醇。此外，未检出¹³C标记乙酰辅酶A，提示T. mu不具备功能性脂肪酸β-氧化通路（图4A）。结果表明，T. mu可合成鞘氨醇，其合成途径大概率是以双碳单元延伸十四碳脂肪酸，而非直接利用棕榈酸合成。脂肪酸延伸所需的双碳供体可由葡萄糖分解代谢生成，与预期一致，T. mu可生成¹³C标记鞘氨醇；但与棕榈酸示踪体系结果相同，仅能检测到双¹³C标记型鞘氨醇（图4B）。在葡萄糖示踪体系中，虽然可以推测葡萄糖来源的乙酰辅酶A经丙二酰辅酶A来延伸14碳脂肪酸合成棕榈酰辅酶A，但考虑到棕榈酸示踪体系中没有双碳标记的乙酰辅酶A产生，提示T.mu应该不是通过乙酰辅酶A-丙二酰辅酶A途径合成双碳标记的鞘氨醇，可能是通过其他途径来生成丙二酰辅酶A然后进入鞘氨醇合成。两套示踪体系中均检出双¹³C标记草酰乙酸，据此推断T. mu可利用草酰乙酸作为合成鞘氨醇的替代双碳供体。草酰乙酸存在多条合成途径：可由丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸或苹果酸转化生成。糖酵解产生的三¹³C标记丙酮酸无法进一步羧化生成三¹³C标记草酰乙酸（图4C-D）。¹³C标记葡萄糖体系可通过未知代谢通路生成双¹³C标记丙酮酸，而¹³C棕榈酸体系中未检出该标记丙酮酸，由此排除丙酮酸羧化酶(PYC)介导的合成通路。T. mu为厌氧菌，理论上优先利用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)通路，但实验未检出双¹³C标记磷酸烯醇式丙酮酸（图4D）。与之相反，两套示踪体系中均存在双¹³C标记苹果酸，证明草酰乙酸主要通过苹果酸脱氢酶(MDH)途径合成。T. mu为厌氧菌，其三羧酸(TCA)循环并不完整；实验同步检出双¹³C标记顺乌头酸与异柠檬酸，提示苹果酸可能来源于乙醛酸循环。鉴于T. mu具备α-氧化通路，因此提出假说：棕榈酸可经持续α-氧化与乙醇酸脱氢生成乙醛酸。结合基因组佐证数据，本研究结果证实T. mu演化出一套独特的鞘氨醇合成通路（图4E）。
图4.T. mu通过一种全新机制生成鞘氨醇
研究总结
综上，本研究提出了T. mu特有的鞘氨醇合成通路，T. mu自身合成的鞘氨醇可经鞘氨醇-SPHK1/2-S1P-S1PR信号轴加重宿主AILI。本研究解析的T. mu调控药物性肝损伤机制具备广泛参考价值，证明肠道微生物的调控作用并不局限于细菌，肠道真核微生物可通过肠-组织轴远距离调控远端脏器对药物损伤的易感性。此外，本文构建了T. mu鞘氨醇合成的全新作用模型，深化了学界对这类长期被忽视的单细胞原生动物特有代谢通路的认知。
