文章标题：RIN enhances plant disease resistance via root exudate-mediated assembly of disease-suppressive rhizosphere microbiota

发表期刊：Molecular Plant

影响因子：27.5

合作单位：南京农业大学

百趣提供服务：GC-MS非靶标代谢组学

全球范围内植物病虫害呈上升趋势，造成高达30%的全球作物收获损失，迫切需要更有效的害虫防治方法。实现这一目标的一种方法是通过将抗性基因（R基因）引入植物基因组，培育或基因工程作物植物，使其对病原体更具抗性，这可以帮助植物检测病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecular pattern, PAMPs)并启动PTI触发免疫(Pattern-triggered immunity, PTI)，或识别病原体效应蛋白并引发效应触发免疫(Effector-triggered immunity, ETI)。成熟抑制因子(Ripening Inhibitor, RIN)转录因子是控制果实成熟的关键调控因子。虽然RIN也影响其他生理过程，但其在触发与根际微生物群相互作用和植物健康方面的潜在作用尚不清楚。在这项研究中，作者测试了番茄成熟抑制因子(Ripening Inhibitor, RIN)对根际微生物介导的青枯罗尔斯顿菌抗病性的潜在贡献，番茄乙烯受体基因的突变可以显著改变根际细菌群落的组成，而其他研究则将乙烯途径与细菌和线虫类群通过根分泌物的差异吸引力联系起来。因此，作者假设RIN可能通过乙烯途径，通过改变控制复杂植物-病原体-微生物相互作用的根渗出模式，间接促进对茄枯菌的抗病性。

作者首先测试了野生型(Wild Type, WT)和等位基因RIN突变番茄植株(以下简称“rin”)抗番茄枯萎病的抗病能力。发现除了促进果实成熟（图1 A）外，RIN还略微提高了无菌土中植物的抗病性，与rin植物相比，WT植物的疾病严重程度（图1 B）和病原体丰度（图1 C）较低。而在天然微生物群存在的情况下，WT中疾病严重程度（图1 D）和病原体丰度（图1 E）明显降低。这表明，RIN对抗病性的影响也是通过与天然根际微生物群的相互作用实现的。

图1. RIN依赖的抗病性由植物基因型和天然根际微生物群之间的相互作用介导

为了更好地了解根际微生物群在抗病性中的作用，作者利用宏基因组学研究了WT和rin植株在结实期微生物群的差异，发现虽然少数细菌门富含RIN微生物组，但放线菌门的RIN相对丰度明显低于WT植物。此外，茄枯菌和放线菌的相对丰度呈负相关（图2 C），表明放线菌可能通过抑制番茄红霉的生长来降低疾病的严重程度。WT植物细菌微生物组也更加多样化，并且具有更多连接的协同网络，边和节点更多，路径长度更短（图2 D），放线菌在WT和rin微生物组共现网络中形成了明确定义的簇（图2 D）；在WT植物中驱动微生物组结构的13个属中，有9个属属于放线菌（图2 E），表明放线菌在植物发育中的作用在WT中比在rin中更明显。在苗期和花期，WT和rin植物之间的分类和功能差异已经明显与我们在图1 B-E观察到的微生物介导的疾病严重程度降低的差异一致。这些结果表明，RIN可能通过放线菌的富集影响番茄根际微生物组的组装和抗生素基因的相对丰度。

图2. 宏基因组测序数据显示RIN增加了放线菌和与抗生素相关的功能基因的相对丰度

为了更好地从机制上理解为什么WT植物与不同的微生物群和更高的放线菌丰度相关，作者重点分析了番茄根系分泌物的差异。通过水培试验，发现rin植株的根系渗出模式发生了明显的变化。此外，rin植物渗出液中脂肪酸的丰度较高，但有机酸、醇、核苷酸和糖的丰度较低（图3 B）。据报道，根分泌物可以塑造宿主相关微生物群和宿主健康，作者比较了WT和rin植物根分泌物在结实期对同一天然土壤微生物组组成的影响，发现WT和rin植物分泌物对细菌群落组成的影响不同（图3 D），并且相对于rin渗出物，WT渗出物更明显地增加了放线菌的相对丰度（图3 E）;这些结果表明，与rin植物相比，WT植物根系分泌物更明显地增加了放线菌的相对丰度。

图3. 病原抑制放线菌的招募是由番茄根系分泌物驱动的

为了探究不同根分泌物是否会导致疾病严重程度的变化，作者重点研究了五种化合物:核黄素、3-羟基黄酮、水杨酸、槲皮素和酒石酸（图3 C）。作者测试了这五种化合物在天然番茄根际微生物群存在的情况下对疾病严重程度的间接影响。结果发现，施用核黄素可部分降低疾病严重程度，而经过3-羟基黄酮处理的rin植物则表现出更大程度的疾病严重程度降低（图3 F），表明这两个化合物对病原体有间接的负面影响。为了验证这一点，作者单独比较了核黄素和3-羟黄酮对番茄根际微生物组组成的影响，结果两种化合物对天然土壤微生物组的调节显著改变了细菌群落组成（图3 G），导致放线菌的相对丰度增加（图3 H）。这些结果表明，RIN对微生物组介导的抗病和放线菌招募的影响可以通过3-羟黄酮和核黄素的分泌来解释，这两种物质从幼苗期开始在WT植物根际中就比较丰富。为了直接验证放线菌对番茄红霉生长的拮抗作用和对番茄病害的缓解作用，从WT植株结实期根际土壤中分离出了143株放线菌。其中，48株链霉菌在室内平板实验中明显抑制了番茄红霉的生长，45株(93.8%)在温室实验中显著降低了植株的病害严重程度（图4），表明放线菌门通过直接抑制病原体在微生物介导的抗病性中发挥关键作用。

图4. 链霉菌对茄青霉病原菌抑制作用的验证

由于RIN位于乙烯信号通路和其他已知的重要生理通路之间，作者预测RIN对根际微生物群的影响可能是由于RIN对乙烯的响应降低所致。为了研究乙烯在疾病严重程度和放线菌招募中的作用，作者使用了ERF过表达的番茄突变体，该突变体过表达乙烯应答转录因子ERF-A3，并表现出乙烯过敏和增强的抗病性。发现相对于WT植物，ERF-A3-OE植株的疾病严重程度显著降低（图5 A），而且对根际细菌微生物群的功能和结构特征有显著影响（图5 B-D） 。与WT和rin植物相比，ERF-A3-OE植物表现出明显改变的根分泌模式（图5 F），而且3-羟基黄酮和核黄素的分泌有所增加（图5 G）。因此，RIN效应可能与对乙烯的敏感性以及除放线菌外的其他抑制微生物的潜在招募有关。

图5. RIN和ERF.A3对结实期植物抗病性、根际微生物组成和根系分泌物的影响

作者在实验中使用的常规rin突变体是rin的功能增益突变体，它产生一种抑制果实成熟的蛋白质。作者用另一个番茄品种(S.lycopersicum cv.)重复了实验。在此背景下，Ailsa Craig（以下简称“AC”）和两个纯合的rin-KO突变系（以下简称“rin-KO-line1”和“rin-KO-line2”）证实了在微生物群缺失和存在的情况下，RIN在疾病发展中的作用。与rin植物类似，在无菌和自然土壤中，与AC WT相比，rin-KO突变体具有更高的疾病易感性并含有更多的病原体（图6 A-D）。此外，在植物发育过程中，微生物群对疾病严重程度的相对影响增加，而对植物基因型的相对影响保持不变(图6 E和F)。这表明敲除RIN也降低了AC品种中微生物组介导的抗病能力。最后，作者使用16S-rRNA扩增子测序和非靶向代谢组学技术比较了rin-KO突变体与rin突变体对番茄根际微生物群聚集的影响，以及两株突变体中核黄素和3-羟黄酮分泌上的差异。试验结果表明，抑制或敲除RIN对番茄根系分泌物和疾病抑制微生物群的募集有类似的影响（图7）。

图6. rin-KO突变体在缺乏和存在天然微生物群的情况下都表现出较低的抗病性，这与根系渗出和抑制疾病的微生物群的聚集受损有关

图7. 通过根分泌物介导的疾病抑制菌群募集，总结了RIN在植物免疫中的作用的示意图

本研究发现植物发育基因可以通过对植物根系分泌物和微生物组组装的影响来控制微生物组介导的抗病性，从而使植物能够利用微生物组编码的基因和功能。这可能为全生物水平的育种铺平道路，其目的是将植物遗传与相关的有益微生物相匹配。本研究鉴定出的关键化合物核黄素和3-羟黄酮可以提高微薄毛囊WT植株的抗病性，这表明维生素和黄酮类化合物可能作为益生元应用于改善植物健康。在未来，需要做更多的工作来了解不同类型的根分泌物之间的潜在协同作用，以及它们如何共同驱动放线菌外微生物群的功能。