英文题目：Antioxidant potential of peptides from poultry hemoglobin via probiotic-assisted hydrolysis: Deciphering mechanisms at the cellular level and through molecular dynamics simulations
中文题目：通过益生菌辅助水解从家禽血红蛋白中提取的肽的抗氧化潜力：分子动力学模拟在细胞水平上解读机制
发表期刊：Food Research International
影响因子：8.0
作者单位：合肥工业大学
百趣提供服务：多肽组学
研究背景
活性氧自由基(Reactive Oxygen Species, ROS)的过度积累会导致氧化应激，持续的氧化应激进一步诱发大多数慢性疾病，为了防止自由基对人体的损害，学者们开始研究自由基的作用和保护机制，以进一步了解自由基与疾病的关系，寻找合适的抗氧化剂进行保护。动物血液富含高质量的血红素铁和功能性蛋白质，是生物活性肽的宝贵来源，目前对畜禽血液中抗氧化肽的研究主要集中在从血浆蛋白中制备具有抗氧化活性的肽，而对血红蛋白抗氧化肽的研究则不太常见。在加工工艺方面，大多局限于蛋白酶消化血红蛋白制品的功能活性，利用益生菌协同蛋白酶水解血红蛋白制备抗氧化肽的研究鲜有报道，此研究旨在从血红蛋白中快速筛选抗氧化肽并探讨其抗氧化机制
技术路线
研究结果
1、鸡血红蛋白水解物(CHHs)的分离和纯
使用10 kDa和3 kDa超滤膜分离CHHs，得到三个部分:M1 (<3 kDa)、M2 (3 kDa~10 kDa)和M3 (>10 kDa)。通过评价不同馏分的DPPH自由基清除活性、金属离子螯合能力、羟基自由基清除活性和还原能力，以确定具有最佳抗氧化活性的馏分。观察到M1馏分具有最高的抗氧化能力，显著高于其他馏分（图1）。将M1组分进一步分离成四个峰（图2），与其他馏分相比，P1馏分具有更好的抗氧化活性。
图1 CHHs不同级分抗氧化活性
图2 CHHs的凝胶色谱纯化及不同组分的抗氧化活性
2、肽序列的鉴定
对P1馏分的肽组成进行了表征，鉴定出了149种肽，肽的长度从6到25个氨基酸不等，超过50%的肽链短于10个氨基酸，这些肽来自6种不同的蛋白质（图3），有研究表明，由2-10个氨基酸组成的短链肽，具有更强的抗氧化活性，这可能解释了P1馏分的优异抗氧化性能。
图3 P1馏分的肽组成表征
3、生物活性肽计算机虚拟筛选结果分析
通过Peptide Ranker服务器、CPP-pred软件以及BIOPEP-UWM数据库对生物活性肽进行筛选。结果显示149个肽片段均无毒性，此外，KLRVDPVNFKLL和GLWGKV都表现出潜在的生物活性和生物可及性得分高于0.5，表明它们可能具有抗氧化活性并在细胞中发挥保护作用。使用BIOPEPUWM数据库进行功能预测，筛选出了具有抗氧化活性的LIVYPW、GLWGKV两种肽（图4）。基于鉴定结果，已知GLWGKV来源于血红蛋白亚基β，而LIVYPW存在于血红蛋白亚基β、血红蛋白亚基ε和血红蛋白亚基rho中。
图4 两种肽的二级质谱图
4、肽与Keap1的相互作用
Keap1-Nrf2通路在调节细胞内氧化应激中起着关键作用。Keap1的Kelch结构域对Nrf2具有特异性结合亲和力，这促进了其泛素化和随后的凋亡，因此，抑制Keap1-Nrf2相互作用可以有效阻止Nrf2的降解，促进下游抗氧化酶的转录。对肽GLWGKV(GT)和LIVYPW(LT)与Keap1蛋白进行了分子对接分析。GT和LT都与Kelch结构域中央腔内的关键氨基酸残基（Tyr334、Ser363、Arg380、Asn382、Gln530等）相互作用，显示出与天然配体相似的结合模式（图5）。因此，可以推断这两种肽的抗氧化途径可能是由于通过占据Keap1上的Nrf2结合位点而破坏了Keap1-Nrf2相互作用，从而激活了Nrf2信号途径。
图5 肽GLWGKV(A)和LIVYPW(B)与Keap1的分子对接和2D图像
5、分子动力学模拟分析
为了进一步探索小分子和蛋白质之间的相互作用，对蛋白质-配体复合物进行了200ns的分子动力学模拟（图6）：在RMSD曲线中没有观察到明显的不连续性，表明化合物保持稳定地结合在蛋白质囊中而没有脱离，形成稳定的复合物，从而实现了动态平衡。比较平衡复合物的RMSD涨落，Keap1-GT复合物的RMSD略低于Keap1-LT，表明Keap1与GT的结合比LT更稳定。RMSF用于表征模拟过程中蛋白质链中每个氨基酸的构象变化。较大的RMSF值表明氨基酸残基的构象灵活性较大。根据RMSF图，在蛋白质-小分子复合物中，只有小部分氨基酸显示出显著的构象变化(在残基380和480附近)，表明GT和LT的加入对Keap1蛋白的整体结构稳定性影响较小，显示复合物稳定，同时也是观察到复合物的RMSD值变化最小的主要原因之一。
为了分析由一级和二级位点结合形成的复合物的相对紧密性和稳定性，测量目标蛋白的Rg。Rg值越低，蛋白质结构越紧凑；Rg值越高，结构越无序。基于Rg图，复合物的旋转半径减少并达到平衡，表明蛋白质与化合物的结合增强了疏水相互作用和蛋白质内部的有效相互作用，从而提高了复合物的稳定性。为更好地显示Keap1和肽之间的相互作用，研究者分析了整个模拟过程中蛋白质和小分子之间形成的氢键数量的变化。分析显示GT与Keap1蛋白的氢键数量多于LT，意味着Keap1-GT复合物更稳定。通过分析受体和配体结合能的变化，可以清楚地分析相互作用。负的结合自由能值(Gbind)表示系统稳定，结合自由能越低，复合物越稳定。从表1中可看出Keap1-GT复合物比Keap1-LT更稳定。总之，GT，LT和Keap1蛋白之间的强亲和力有助于形成稳定的复合物，这可能是这些肽的抗氧化活性的原因。
图6 200 ns分子动力学模拟期间Keap1蛋白和GLWGKV之间的分子相互作用
表1 肽GT和LT与Keap1蛋白的结合自由能
6、模拟胃肠消化对肽稳定性的影响
对化学合成的LT和GT肽模拟体外胃肠消化。结果显示（图7），酶解后二者羟自由基清除活性、金属离子螯合能力均显著高于未酶解肽，但LT的DPPH自由基清除能力显著下降，因胃蛋白酶、胰蛋白酶切割肽键有pH依赖性和特异性，推测LT中C端亮氨酸在消化中降解，致使其DPPH自由基清除能力降低。有趣的是，在模拟消化过程中，GT抗氧化活性的整体增强表明，胃肠消化可能会破坏L-位点的肽，产生更小的肽或氨基酸，如G、L和WKV。这些较小的片段可以通过改变连接构象和释放疏水性氨基酸来增强抗氧化性能。
图7 体外胃肠消化对肽的抗氧化活性的影响
7、H₂O₂诱导的Caco-2细胞氧化损伤模型的构建及GT对细胞的保护作用
GT对Caco-2细胞没有明显的细胞毒性，且将Caco-2细胞暴露于H₂O₂中4小时，细胞活力以浓度依赖的方式显著降低（图8A）。选择800 μM的H₂O₂处理4小时来建立Caco-2氧化应激模型。与模型组相比，用200 μM GT预处理的组别中细胞活力显著提升，该效果与用200 μM谷胱甘肽(GSH)处理的结果相比无显著性差异（图8B）。
图8 GT、GSH、H2O2对Caco-2细胞生存力的影响
8、多肽对H₂O₂诱导的Caco-2细胞抗氧化酶活性和丙二醛含量的影响
为了进一步阐明GT对H₂O₂诱导的Caco-2细胞氧化损伤的保护机制，对抗氧化酶进行研究，结果表明GT对H₂O₂诱导的Caco-2细胞氧化损伤的保护作用可能是由于它能够增强抗氧化酶如SOD、CAT和GSH-Px的活性，以浓度依赖的方式减少MDA的生成而发挥作用。
图9 GT对Caco-2细胞抗氧化酶活性和丙二醛含量的影响
9、GLWGKV对Nrf2-Keap1通路相关蛋白表达的影响
为进一步阐明肽GT的抗氧化机制，研究了Keap1-Nrf2途径相关蛋白(Nrf2, HO-1, 和NQO1)，结果显示当用GT(50、100和200μM)预处理细胞时，这些蛋白的表达显著增加，且呈剂量依赖性（图10），表明GT促进了Nrf2核转位，从而激活了Nrf2信号通路并导致HO-1和NQO1表达上调，分子对接和蛋白质印迹分析的结合证实GT能够与Keap1相互作用，占据Keap1-Nrf2复合物上的Nrf2结合位点，使Nrf2从复合物中解离出来，转移到细胞核中，形成Nrf2-Maf异二聚体。一旦进入细胞核，Nrf2-Maf复合物就与ARE序列结合，从而启动由ARE调节的抗氧化酶基因的转录（图11）。
图10 GT和GSH激活Caco-2细胞中的Keap1/Nrf2通路
图11 GT在Caco-2细胞内的抗氧化作用机制示意图
研究结论
本研究提出了从血红蛋白中快速筛选抗氧化肽的策略，并揭示了分子和细胞水平的抗氧化机制。通过详细了解抗氧化肽的构象关系和抗氧化保护机制，为肽基抗氧化剂的未来发展奠定了基础，并加速了副产物向营养化的转变和功能性食品的开发。
多肽组学：是以机体内源性多肽和低分子量蛋白质为研究对象，研究多肽组的结构、功能、变化规律及其相关关系。多肽通常被定义为一个2~100个氨基酸链，分子量在200Da到10kDa之间的分子。多肽组学被认为是连接蛋白组学和代谢组学的“桥梁”。
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