发表期刊：Journal of Nanobiotechnology
影响因子：10.2
客户单位：中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院
百趣提供服务：氧化三甲胺高通量靶标
骨质疏松症(Osteoporosis, OP)是一种代谢性骨病，其特征是骨量减少和骨脆性增加。金纳米球(Gold nanospheres, GNS)作为一种常见的金纳米颗粒，具有显著的抗菌抗炎活性，已被应用于治疗眼疾病和类风湿性关节炎。然而，GNS对骨质疏松症的影响仍不明确。有研究表明肠道微生物群可能参与调节骨代谢和骨质疏松症的进展，且氧化三甲胺(Trimethylamine N-oxide, TMAO)参与了骨骼健康的维持，但其潜在机制尚不清楚。卵巢切除术(ovariectomy, OVX)诱导的小鼠骨质疏松症模型已被广泛用于模拟骨质疏松症的典型临床表型，因此本研究采用OVX骨质疏松小鼠来研究GNS是否对骨质疏松症有治疗作用。作者结合肠道微生物测序和氧化三甲胺的检测，证明了GNS作为肠道微生物群调节剂对骨质疏松症有保护作用，并为“肠-骨”轴的调节提供了新的见解。
图1. 研究流程
组织学分析结果显示，GNS给药对小鼠的肾脏和肝脏没有不良影响，并具有良好的生物相容性。对股骨小梁和皮质骨的轮廓进行µCT分析图像表明，GNS给药能够减轻OVX小鼠的骨丢失（图2 B）。GNS给药显著增加了骨体积/组织比、骨小梁数量和骨小梁厚度，并减少了骨小梁分离（图2 C-F）。有趣的是，两组之间的骨密度没有显著差异（图2 G）。测试皮质骨的相关指标，包括皮质骨厚度和皮质骨面积都没有显著差异。血清中的Ⅰ型胶原C端肽(C-telopeptide of type I collagen, CTX-1)被认为是反映骨减少进展的相关生物标志物。因此，测量血清中CTX-1的浓度，发现GNS给药显著降低了CTX-1水平，进一步表明GNS对骨丢失的保护作用（图2 J）。这些结果表明，GNS给药显著改善了OVX诱导的骨质疏松症。
图2. GNS给药改善了OVX诱导的骨质疏松症
在GNS给药前使用四种抗生素混合物进行了伪无菌小鼠模型构建（图3 A）。µCT分析表明，ABX(OVX)组与ABX(OVX+GNS)组几乎无法区分（图3 B）。另外GNS给药对骨质疏松症的有益作用包括：骨体积比、骨小梁数量、厚度、分离度、骨皮质厚度及CTX-1的改变，在没有肠道微生物的情况下被完全消除（图3 C-J）。
图3. GNS给药对OVX诱导的骨质疏松症的保护作用在肠道微生物群耗竭后消失
通过粪菌移植(Fecal microbiota transplantation, FMT)方式，隔天灌胃将OVX和OVX+GNS组的微生物群移植到肠道微生物群缺失的野生型小鼠中（图4 A）。FMT(OVX+GNS)组的骨密度和皮质骨面积与FMT(OVX)组相比显著增加（图4G、I），但其他指标和µCT图像显示两组之间没有显著差异（图4B-F、H）。这些不显著的差异结果可能是由于FM移植实验中肠道微生物群的损失导致。这些结果表明，GNS是以肠道微生物依赖的方式减轻了OVX诱导的骨质疏松症。
图4. 粪便微生物群移植减轻OVX诱导的骨质疏松
进一步使用粪便中细菌的16S r测序分析研究了GNS对肠道微生物群多样性和组成的调节作用。如图5A所示，OVX和OVX+GNS组的粪便中共获得6124个菌，其中1403个菌在两组中共有。通过主坐标分析(PCoA)显示，两组之间明显分离，表明OVX+GNS和OVX组的微生物群组成不同（图5 B-D）。
为了研究两组之间肠道微生物群的具体变化，在不同水平上评估了每组分类群的相对丰度。如图5F和5G所示，拟杆菌门和厚壁菌门为两大优势门，有趣的是，OVX+GNS组中厚壁菌门与拟杆菌门的比例显著高于OVX组，表明拟杆菌门对GNS的敏感性更高。此外，GNS给药显著降低了拟杆菌门的水平，但增加了变形菌门和ℇ变形菌门的水平（图5 H）。
图5. GNS给药显著改变了肠道微生物群的多样性
进一步分析属水平的物种分布，发现这两组在肠道微生物群中表现出明显差异（图6 A-B）。幽门螺杆菌属和乳酸杆菌属在GNS给药的小鼠中占据相对较高的比例，而拟普雷沃氏菌属在OVX+GNS组中显示出较少的丰度（图6 C-E）。通过LEfSe和分支图分析结果表明，普雷沃氏菌科、拟杆菌门和真杆菌属是OVX组中促进肠道菌群失调的重要细菌类型。此外，乳杆菌目、螺旋杆菌科、科氏菌目、水藻科、放线菌门和变形菌门在OVX+GNS组中有相对较高的丰度，这可能是GNS介导的骨质疏松症缓解的关键细菌（图6 F-G）。通过热图分析，乳杆菌属和幽门螺杆菌属在OVX+GNS组中显著富集，而异普雷沃菌属和拟杆菌目在OVX组中所占比例更高，这与LEfSe分析结果一致（图6 H）。总之，GNS给药影响了肠道菌群的多样性组成。
图6. 属分类水平上OVX和OVX+GNS组的粪便微生物群组成
为了探究肠道微生物群的改变是否影响TMAO的产生，作者进行了代谢组学分析。与微生物多样性结果一致，OVX+GNS和OVX组具有不同的TMAO特征。在这些代谢产物中，OVX+GNS组的TMA、L-肉碱和TMAO的含量较低。与OVX组相比，OVX+GNS组的总TMAO相关代谢产物在粪便中显著减少（图7 A-B）。
为了确定TMAO水平的变化是否与GNS治疗诱导的肠道菌群改变密切相关，我们在FMT组之间进行了针对性的TMAO定量分析。OPLS-DA和PCA分析结果表明两组之间明显分离。FMT(OVX+GNS)中TMAO相关代谢物的产生也显著低于FMT(OVX)组（图7 C）。FMT(OVX+GNS)组的肌酸酐和氧化三甲胺浓度显著低于FMT(OVX)组。总之，GNS给药通过调节肠道微生物群的多样性来降低代谢产物TMAO的丰度。
图7. GNS给药减少了肠道微生物群的TMAO相关代谢产物的产生
为了更好地确定肠道微生物群和代谢产物TMAO之间的联系，作者进行了肠道微生物组和代谢组的联合分析。如关联分析热图所示，17个属与TMAO相关代谢产物具有显著相关性，其中12个属与TMAO相关代谢产物呈正相关，5个属呈负相关。接着为了进一步展示肠道微生物菌与TMAO相关代谢产物之间的相关性，作者根据17个属和TMAO代谢产物构建了一个关联网络图（图8 B）。总之，这些结果提供了肠道微生物群和TMAO代谢产物之间的关系，这有助于进一步的体外研究。
图8. 肠道微生物组和代谢组的联合分析
骨质疏松症是一种慢性炎症性疾病，其中IL-1、IL-6和TNF-α等促炎细胞因子通过促进破骨细胞分化和活化以及抑制成骨细胞分化来加速骨丢失。此外，TMAO水平已被证明与促炎细胞因子水平的增加有关。进行了细胞因子微阵列分析，以探讨GNS是否诱导血清中不同细胞因子的改变。如热图所示，与OVX组相比，OVX+GNS组的促炎细胞因子IL-6、TNF-α和G-CSF显著降低（图9 A）。火山图显示GNS诱导的差异表达细胞因子与热图一致（图9 B）。总之，GNS给药显著下调了促炎细胞因子的释放，这可能与TMAO的减少有关（图10）。
图9. GNS治疗显著改变了OVX小鼠的炎症细胞因子谱
图10. GNS通过调节微生物群稳态及相关TMAO代谢对OVX诱导的骨质疏松症的保护作用机制示意图
本研究发现GNS可以以肠道微生物群依赖的方式显著减轻OVX诱导的骨质疏松症。GNS给药调节了骨质疏松症相关肠道微生物群的多样性，并降低了TMAO相关代谢产物的丰度，从而进一步降低了骨代谢中促炎细胞因子的水平，最终改善了骨质疏松症状。另外进行了FMT来证明这种肠道菌群依赖性机制。综上，GNS可以通过调节肠道微生物群有效改善骨质疏松症，这可能是一种新的、有前景的治疗骨质疏松的药物。
