文章标题：Released palmitic acid–mediated TLR4/NF-κB activation enhances the virulence of Bordetella pertussis MT28 lineage

发表期刊：nature communications

影响因子：18.1

客户单位：上海交通大学医学院附属仁济医院

百趣提供服务：游离脂肪酸高通量靶标定量

研究背景

百日咳由百日咳杆菌(Bordetella pertussis)引起，传染性强，婴幼儿感染后重症与死亡风险更高。全球百日咳疫苗覆盖率超80%，我国近十年无细胞百日咳疫苗(aPVs)覆盖率近99%，但国内外病例仍持续反弹。

病原菌遗传变异是百日咳疫情复燃的重要因素之一，携带高毒力ptxP3等位基因的菌株定植、产毒能力更强，逐步替代旧ptxP1谱系。2020年前国内主流菌株为大环内酯耐药ptxP1-MT195/104/55、敏感ptxP3-MT27；2020年后兼具ptxP3高毒力与大环内酯耐药的ptxP3 MR-MT28(MT28)成为优势流行株。MT28谱系2007年自欧洲传入我国，2016年通过23S rRNA基因A2047G单点突变获得大环内酯类抗生素耐药；该菌株部分亚型存在不完整prn基因，即预测的PRN缺陷株，可能存在潜在免疫逃逸风险，且已发生跨国传播。

现有研究仅阐明MT28的流行病学分布及耐药特征，其在高疫苗覆盖人群中广泛传播、强致炎的分子机制尚不明确。本研究整合临床流行病学调查、多组学与体内外功能实验，对比MT28与既往流行株的致病差异，解析其脂质代谢重塑、棕榈酸介导TLR4/NF-κB通路的高毒力致病机制。

研究结果

01.百日咳流行病学与流行菌株分子特征

本研究于2024年4月—2025年4月纳入13911例伴咳嗽、疑似呼吸道感染患者开展流行病学调查（图1a），百日咳杆菌核酸总阳性率12.63%，累计确诊1757 例；上海核酸阳性率11.04%，宁波为21.10%（图1b）。2024年4—7月为本轮流行高峰，月度核酸阳性率均高于15%，此后逐月下降（图1c）。

病例以6～18岁青少年为主，占全部确诊患者60%；成人病例占15.08%，全年持续检出（图1c）。确诊病例中超90%存在至少1剂百日咳疫苗接种史，6～18岁青少年均完成全程免疫；多数病例接种aPVs，少数人群接种wPVs 或未接种。临床特征方面，99.35%患者出现特征性阵发性咳嗽；11.39%合并肺炎/支气管肺炎，全程免疫的6～18岁青少年肺炎发生率达13.88%，为各年龄组最高。超10%患者外周血白细胞及CRP、SAA、PCT等炎症标志物升高；8.31%患者核酸阳性持续7天以上，青少年核酸持续阳性占比最高(10.6%)，提示现行疫苗保护作用有限，当前优势流行菌株定植能力与致病力更强。

本研究从临床标本中共分离16株百日咳杆菌，分型均为MT28（图1a）。2020年前我国两大主流流行菌株分别为大环内酯耐药ptxP1-MT195/104/55、大环内酯敏感ptxP3-MT27；系统发育树显示ptxP1与ptxP3菌株各自形成独立进化支，MT28由ptxP3谱系演化而来（图1d）。MT28与MT27的BPagST抗原分型一致，但仅MT28携带prn150等位基因；2019年后各谱系中prn基因不完整的预测的PRN缺陷株检出占比逐年升高。MT28与MT195携带相同23S rRNA A2047G大环内酯耐药突变，3类菌株均归属于ST2序列型。本研究从3个谱系中各随机选取12株代表菌株（合计36株）开展抗生素药敏试验（图1d），药敏结果显示MT28、MT195对大环内酯类抗生素耐药，MT27对全部受试抗生素均敏感（图1e）。

图1.患者入组流程图与菌株流行病学分析

02.MT28菌株体外致病表型特征

本研究体外对比三类菌株的生长动力学、生物膜形成、上皮细胞侵袭及巨噬细胞促炎能力。生长曲线结果显示，百日咳杆菌浮游培养24 h达到对数生长中期，48 h进入稳定期；培养至60 h时MT28菌体密度显著低于MT27（图2a）。结晶紫半定量染色证实MT28生物膜形成能力显著优于MT27（图2b）；激光共聚焦显微镜可直观观察生物膜形态，并对生物膜密度、结构完整性进行定量分析（图2c）。细胞侵袭实验结果显示，相较于MT27、MT195，MT28对人肺腺癌A549细胞的侵袭能力更强（图2d）；三类菌株侵袭鼻咽上皮RPMI 2650细胞的能力无统计学差异。RAW264.7、THP-1巨噬细胞感染模型显示，MT28可诱导巨噬细胞产生更高水平IL-1β蛋白，同时上调IL-1β编码基因的转录表达（图2e-f）。综上，MT28生长动力学特征存在显著差异，体外呼吸道定植能力、促炎潜能均显著优于既往流行菌株；三类谱系内的PRN缺陷菌株各项体外表型均无明显组间差异。

图2.三种百日咳杆菌谱系的体外特性

03.基于小鼠感染模型分析MT28的体内定植、致病与促炎特征

本研究构建小鼠鼻腔感染模型，在多个时间点观察小鼠存活情况、咳嗽症状、呼吸道细菌定植量及机体炎症水平（图3a）。观察周期内，MT28感染组、MT27感染组各出现1例小鼠死亡，分别发生于5 dpi（days post infection，感染后天数）、7 dpi；MT195组无小鼠死亡（图3b）。分别于感染后2 h、4 dpi、7 dpi、12 dpi对鼻腔、气管、肺组织菌落计数，结果显示细菌初期主要定植于鼻腔，4 dpi逐渐向肺部侵袭扩散；4 dpi时MT28在三类组织的细菌负荷量均显著高于另外两株，7 dpi仅鼻腔定植水平显著优于MT195（图3c）。小鼠自4 dpi开始出现咳嗽症状，7 dpi咳嗽程度达到峰值；MT28感染小鼠咳嗽发生率最高、咳嗽持续时间更长（图3d）。

在4 dpi检测机体炎症因子，MT28组血清及肺组织TNF-α、IL-1β、IFN-γ表达水平显著升高；各组血清IL-6、IL-17无统计学差异，但MT28小鼠肺组织Il17基因转录丰度最高（图3e-f）。HE染色可见全部感染组均存在呼吸道黏膜损伤与肺部炎性浸润，MPO免疫组化染色证实MT28组中性粒细胞浸润程度最重（图3g-j）。同笼共居传播模型结果显示，MT28组继发感染率最高，达20%，但三组间传播差异无统计学意义。综上，体内动物实验证实MT28具备更强的组织定植能力，可诱导宿主产生更为剧烈的炎症反应。

图3.三种百日咳杆菌菌株的小鼠鼻腔感染模型

04.游离脂肪酸介导MT28菌株高促炎表型的分子机制

为揭示MT28菌株强致病表型的分子机制，本研究对同属ptxP3进化分支的MT28与MT27菌株开展转录组差异分析。主成分分析显示两菌株基因表达谱存在显著差异（图4a），共筛选得到1490个差异表达基因，其中MT28菌株有806个基因上调、684个基因下调（图4b）。

火山图分析表明，MT28菌株BvgAS毒力调控通路关键基因bvgA表达水平显著升高，进而驱动下游多个关键致病基因上调，包括调控呼吸道早期定植与毒素合成的ptxA、参与细菌黏附和生物膜形成的tcfA、fhaB（图4c）。研究通过36株临床菌株的RT-qPCR验证，确认MT28菌株毒力基因呈稳定高表达特征（图4d）。

KEGG通路富集分析提示，差异基因显著富集于脂肪酸合成与降解代谢通路（图4e）。MT28菌株脂肪酸分解相关基因显著下调，脂肪酸合成基因显著上调（图4f），提示该菌株游离脂肪酸(FFA)合成能力更强。基于此，本研究提出假说：MT28菌株分泌的游离脂肪酸是其促炎能力增强的关键因素。

细胞实验验证上述假说，百日咳杆菌浓缩上清液可显著激活巨噬细胞促炎反应；利用DM-β-CD络合并去除游离脂肪酸后，上清液诱导的炎症效应明显减弱，且不影响巨噬细胞基础炎症水平。综上证实，细菌释放的游离脂肪酸是介导MT28菌株高促炎表型的重要机制。

图4.ptxP3型MT28和MT27菌株的原核链特异性转录组测序

05.棕榈酸介导MT28菌株高促炎表型

为筛选介导百日咳杆菌促炎效应的关键游离脂肪酸，本研究分别收集MT28、MT27、MT195菌株培养上清进行脂质组学分析。OPLS-DA结果显示，MT28的脂质代谢谱与另外两株菌株存在显著分离（图5a）。多种游离脂肪酸在MT28上清中表达上调，其中棕榈酸(PA)丰度最高、组间差异最突出，是区分三类菌株表型的关键脂质标志物（图5b-c）。

采用LC-MS对36株临床分离菌株上清中的棕榈酸开展绝对定量检测，证实MT28谱系菌株上清棕榈酸含量显著高于MT27。结合已有文献与CCK-8细胞毒性检测，本研究选定20 μg/mL无细胞毒作用的棕榈酸开展体外功能验证；同等浓度棕榈酸处理不会改变百日咳杆菌生物膜形成能力。

细胞体外功能实验（图5e）显示，棕榈酸单独刺激即可诱导RAW264.7、THP-1巨噬细胞大量释放促炎因子并上调炎症相关基因转录；同时棕榈酸可显著放大三类百日咳菌株诱导的炎症应答。采用DM-β-CD螯合清除体系内游离脂肪酸后，棕榈酸诱发的细胞脂质蓄积与炎症激活效应显著减弱。

综上，棕榈酸是介导百日咳杆菌促炎表型的核心游离脂肪酸；MT28菌株促炎潜能显著增强，重要机制是该菌株自身棕榈酸合成与分泌水平大幅升高。

图5.百日咳杆菌菌株中棕榈酸的脂质谱分析及其促炎效应

06.棕榈酸依赖TLR4/NF-κB通路诱导百日咳杆菌促炎反应

TLR4是宿主抵御细菌感染的关键模式识别受体。Western blot结果显示，棕榈酸单独刺激或MT28菌株感染均可激活巨噬细胞TLR4，上调下游MyD88、IRAK4 及磷酸化 p-p65 信号蛋白表达（图6c）。采用TLR4特异性抑制剂TAK-242预处理巨噬细胞后，TLR4/MyD88/IRAK4/NF-κB信号级联活化被显著阻断；棕榈酸单独刺激、百日咳杆菌感染所诱导的TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白分泌与基因转录同步明显下调，该现象在RAW264.7、THP-1两类巨噬细胞中表现一致（图6a-b），证实棕榈酸通过TLR4依赖的NF-κB通路发挥促炎作用（图7）。

体内动物实验采用MT28经鼻感染野生型与tlr4^⁻/⁻敲除小鼠。7 dpi时野生型与tlr4^⁻/⁻小鼠鼻腔、气管、肺部细菌负荷无统计学差异（图6d），但tlr4^⁻/⁻小鼠血清及肺组织促炎因子水平显著降低（图6e-f）；HE、MPO 染色证实，tlr4^⁻/⁻小鼠肺部炎性损伤、中性粒细胞浸润程度均明显减轻（图6g-j）。综合体内、体外实验结果证实，棕榈酸通过激活TLR4/NF-κB信号通路放大百日咳杆菌感染诱发的宿主炎症应答。

图6.棕榈酸通过TLR4/NF-κB信号通路发挥促炎作用

图7.图形摘要

研究总结

本研究系统解析国内流行优势ptxP3大环内酯耐药MT28菌株的致病机制。体外实验表明，相比MT27、MT195，MT28生物膜形成、细胞侵袭及促炎能力更强，各谱系PRN缺陷株表型无显著差异。小鼠感染模型证实MT28早期呼吸道多组织定植优势突出，可诱发更剧烈咳嗽与肺部炎症。 转录组显示MT28毒力基因普遍上调，脂肪酸合成通路激活，游离脂肪酸分泌增多；脂质组学筛选明确棕榈酸为关键促炎脂质。体内外机制验证证实，棕榈酸通过TLR4/NF-κB通路放大炎症；tlr4^⁻/⁻小鼠细菌定植不受影响，但肺部炎症与组织损伤明显缓解。 该研究阐明MT28高致病的分子通路，为解释该菌株流行、挖掘百日咳防治新靶点提供理论支撑。