英文标题：Preparation of flavonoids from Amomum tsaoko and evaluation of their antioxidant and α-glucosidase inhibitory activities

中文标题：草果(Amomum tsaoko)黄酮类化合物的制备及其抗氧化与α-葡萄糖苷酶抑制活性的评估

发表期刊：Food Chemistry: X

影响因子：8.2

合作单位：云南农业大学

合作产品：PRM精准植物广靶

研究背景

草果(Amomum tsaoko, AT)是姜科草果属的多年生常绿丛生草本植物，主要分布于中国云南、广西和贵州等地。作为传统中药和“五香”之一的香料，AT具有温中散寒、健胃消食、调节呼吸等药理作用，但其产业因加工链条短、深度开发不足，长期以低附加值香料形式利用，药用价值研究滞后。近年来，AT化学成分研究取得进展，科学家已从中分离出300余种化合物，其中黄酮类成分占比突出，兼具抗氧化（清除自由基）与α-葡萄糖苷酶抑制活性，对糖尿病预防具有潜力。然而，传统提取方法（如浸提、煎煮）难以高效分离黄酮类成分，而超声波辅助提取(Ultrasonic-assisted extraction, UAE)虽利用空化效应破坏细胞壁、提升溶解性，但可能因杂质沉淀影响效率，亟需优化提取条件。大孔树脂(Macroporous resins, MRs)作为工业上低成本、环保的纯化手段，已被用于多种活性成分（如植物黄酮）的分离，但AT黄酮与UAE结合MRs的研究仍属空白。本研究创新性提出“UAE-MRs联合法”，旨在优化AT总黄酮制备工艺，通过不同乙醇浓度洗脱获得高活性成分，并结合靶向代谢组学解析其化学组成，为AT资源的深度开发与药用价值验证奠定基础。

研究结果

1、草果黄酮(ATF)提取条件的优化酮(ATF)提取条件的优化

1.1 单因素实验

在ATF提取优化中，随着浸泡时间增加，12小时后黄酮含量稳定，确定为最佳参数（图1A）；乙醇浓度与固液比：60%乙醇浓度（2.91%产量）与1:35(w/v)固液比（3.11%产量）为最优组合，可平衡溶解效率与溶剂极性（图1B-C）。此外，超声功率、时间及温度对黄酮产量有显著影响（图1D-F）。ATF提取的优化条件为60%乙醇、1:35固液比、180W超声功率、50分钟超声时间、65℃超声温度，为后续工艺开发提供数据支持。

图1. 单因素对AT中黄酮产率的影响

1.2 响应面优化实验

基于表S2的数据建立了多元二次回归模型，用于构建提取工艺参数的回归模型。该模型具有高度显著性和良好拟合性，且预测值与实际值之间存在强相关性，模型适用于分析。如图2所示，两变量间的交互作用对黄酮产量有显著影响；同时，各因素对黄酮产量的影响顺序为：A（固液比与超声功率）>D（超声功率与超声时间）>B（固液比与超声时间）>C（固液比与超声温度）。

图2. 3D响应面图说明了各种参数对类黄酮产量的影响

1.3 模型验证

基于响应面结果，推导并验证了最佳工艺条件：料液比1:39（w/v）、超声功率160W、超声时间47分钟、超声温度69℃。相较类似的提取优化研究，此方案显著节约了乙醇用量，降低了能耗，将提取效率提升至3.33%，验证了所用条件对提升黄酮含量的有效性。

2、大孔树脂分离与纯化草果黄酮

2.1 MR的选择

基于10种所选树脂材料的性能（图3），其中，HPD300具有最小的平均孔径和最大的比表面积（表S1），吸附与脱附能力最优；市场价与X-5、HPD100、HP-20相近，处于中等水平；工业应用广泛，使用寿命长，经2-3次再生仍可维持良好吸附效果，展现出最强的吸附/脱附综合能力及实际大规模应用潜力，因此被选为ATF分离与纯化的候选材料。

图3. 比较了10种MR的吸附和解吸性能

表1. Box-Behnken响应面设计中使用的因素和水平

2.2 吸附动力学

对吸附性能较强的四种大孔树脂（X-5、HPD100、HPD300和HP-20）进行了吸附动力学研究。结果如下：①所有树脂的吸附量均随吸附时间增加而上升，但达到平衡时，HPD300的吸附速率最高，其次为X-5、HPD100和HP-20；②伪二级动力学模型更适用于描述X-5、HPD100、HPD300和HP-20对ATF的吸附过程，其中HPD300对ATF的吸附属于多层吸附过程（表2）；③HPD300的内扩散速率常数（k₃=1.4131）最高，表明ATF在该树脂中扩散更迅速，吸附速率更快、更高效，体现了HPD300的吸附优势。综上，HPD300是ATF吸附的最佳树脂。

表2. 动力学模型的方程和参数

2.3 吸附等温线和热力学

当吸附温度升高(25℃→35℃→45℃)时，HPD300树脂对ATF的吸附容量逐步降低，表明高温不利于其吸附过程（图4A）。基于Langmuir、Freundlich模型（图4B-C）以及模型详细数据（表3），表明Freundlich模型更适于解释HPD300对ATF的吸附机制。此外，25℃、35℃和45℃下的1/n值均处于0.1-0.5范围内，表明HPD300对ATF的吸附在该温度区间内为自发过程。但温度从25℃升至45℃时，1/n值随之升高，说明吸附过程逐渐“硬化”。总体而言，25℃的吸附温度更适于HPD300对ATF的纯化。

表3. 吸附等温线模型拟合出不同温度下的回归方程和吸附参数

图4. (A)在25℃、35℃和45℃温度下，HPD 300上ATF纯化的吸附等温曲线(B)Langmuir模型和(C)Freundlich模型

2.4 HPD300制备ATF工艺条件的优化

随着ATF浓度升高，HPD300的吸附容量逐渐增加，但吸附速率却呈下降趋势，当浓度为2.79 mg/mL，此时吸附容量达平衡且吸附速率稳定（图5A）。此外，样品pH值也显著影响HPD300的性能，在pH 2.0条件下，HPD300树脂表现出最佳吸附性能（图5B）。

树脂-液比(resin-liquid ratio)对纯化效果亦有重要影响，基于图5C综合分析，作者确定最优树脂-液比为1:20。

洗脱条件对ATF纯化效果同样关键。由于黄酮类化合物的化学性质差异，分别采用0%至100%乙醇溶液(v/v)进行梯度洗脱，每种浓度洗脱至无色（图5D）。结果表明：最佳洗脱流速为1.5 BV/h，对应各乙醇浓度的洗脱体积分别为2.3 BV、6.7 BV、16.7 BV、14.3 BV、8.5 BV和3.3 BV。

总的来看，相比前人研究，本方案将ATF含量从21.71%显著提升至90%以上，验证了HPD300树脂对ATF分离纯化的高效性。

图5. HPD 300吸附/脱附净化ATF的条件优化

3、抗氧化和降血糖活性

在抗氧化方面，自由基清除能力和铁离子还原能力均随黄酮类化合物浓度的增加呈正相关（图6A-D），其中，抗氧化能力：30%乙醇洗脱混合物>维生素C(Vc)>20%乙醇洗脱混合物 > 粗提物（ATF粗提物，ATEE）和50%乙醇洗脱混合物表现出较弱的抗氧化能力；各洗脱组分的抗氧化能力排序为：30%>20%>40%>10%>50%>ATEE（表4），其中，20%和30%洗脱组分的抗氧化能力显著强于其他组分。

在α-葡萄糖苷酶活性方面，30%乙醇混合物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率表现出最强的抑制效果（图6E）。基于各洗脱组分的IC50值（表4），30%乙醇混合物的抑制活性最强，其次为20%、40%、10%乙醇混合物，最后是ATEE。这些结果与各乙醇洗脱组分中黄酮类化合物的含量（图6A-D）及抗氧化活性测定结果一致，表明20%和30%乙醇可能是HPD300树脂纯化ATF黄酮类化合物的最佳洗脱剂量。

因此，20%和30%乙醇洗脱组分可作为未来ATF相关研究的重点对象。

图6. 不同乙醇洗脱液和纯化前ATEE的自由基清除活性和α-糖苷酶抑制活性

表4. DPPH、ABTS、羟基自由基和α-葡萄糖苷酶的IC50值

4、纯化ATF的植物化学分析

由于20%和30%乙醇洗脱组分具有更高的黄酮类化合物含量（图7A）及更佳的生物活性，我们通过全植物靶向代谢组学分析了这两组混合物的植物化学成分。总共鉴定出1257种化合物，主要分为黄酮类(73.83%)、多酚类、生物碱类、植物激素类、萜类、芳香族化合物、酮酸类、脂肪酰类、维生素类、核苷酸类及其他类别（图7B-C）。

在黄酮类化合物中，(+)-表儿茶素(24.94%)、异槲皮素(14.02%)、山柰酚(7.66%)、山柰酚-3-O-芸香糖苷(6.84%)、儿茶素B2(5.51%)为主要成分（图7D）。其中，表儿茶素、异槲皮素等可高效清除自由基；槲皮素、芦丁和儿茶素可抑制α-葡萄糖苷酶，黄烷醇类等降低二型糖尿病风险；槲皮素、芦丁等可减少高Fe²⁺引起的溶血。此外，ATF黄酮类成分已被证实用于蜂胶、蜂粮等健康产品，且能缓解功能性便秘。

该部分内容验证了ATF的体外抗氧化和降血糖活性，为其在食品、医药领域的进一步开发提供了科学依据。

图7. 基于广泛靶向代谢组学的ATF主要化学成分

研究结论

在本研究中，作者开发了一种高效的ATF提取与纯化方法，并对ATF提取物的体外抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性进行了评估。确定的最佳提取条件为：乙醇浓度60%、料液比1:39(w/v)、超声功率、时间和温度分别为160W、47分钟和69°C。ATF粗提物(ATEE)的黄酮得率达3.33%。通过HPD300树脂的纯化效率优于其他大孔树脂(MRs)，且其吸附等温线符合Freundlich吸附模型。在优化后的HPD300吸附条件下，使用0%至50%不同浓度的乙醇洗脱可分离出黄酮含量较高的组分。20%和30%乙醇洗脱组分的黄酮含量均超过90%，表现出增强的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制能力。20%和30%乙醇洗脱组分的主要黄酮成分包括表儿茶素、异槲皮素、木犀草素-3-O-芸香糖苷、儿茶素B2和芦丁等。这些发现为ATF的高效制备及AT资源的深度开发与利用提供了理论依据。

PRM精准植物广靶：是专为植物代谢组学研究研发的创新检测技术，结合了非靶标代谢组定性全面与靶标代谢组定量精准的双重优势，针对植物初生代谢物与次生代谢物的复杂特性优化设计，有效解决传统方法在覆盖广度、检测灵敏度及定量准确性上的局限，为植物生长发育、抗逆机制、品质形成等研究提供深度代谢组学解析工具。