文章标题：Functionalized magnetic nanoparticles for sample preparation in proteomics and peptidomics analysis

发表期刊：Chem Soc Rev

影响因子：46.2

发表时间：2013年10月

作者单位：复旦大学

样品制备是蛋白质组学和多肽组学工作流程中的一个基本步骤。近年来，具有不同活性部分的纳米磁珠(magnetic nanoparticles, MNPs)由于其良好的生物相容性、超顺磁性和高结合能力已被证明可以极大地提高蛋白质酶解和富集低丰度肽/蛋白质的效率，在蛋白质组学和多肽组学分析的各种样品制备过程中得到了广泛应用。本文将对功能化纳米磁珠的制备及其在蛋白质组学和多肽组学分析中的样品制备应用进展，包括蛋白质酶解、低丰度肽/蛋白的富集和翻译后修饰肽/蛋白（如磷酸化和糖基化）的特异性富集进行全面和系统的综述。

1. 基于MNPs的蛋白酶解

1.1 MNPs上酶的固定化

经研究发现，可通过两种不同的方法将酶固定在MNPs上（图1）。方法A是首先将蛋白质吸附到功能化的MNPs上，然后将蛋白质吸附的MNP在含有酶的溶液中孵育以进行蛋白质酶解。方法B是首先将酶固定在功能化的MNPs上，然后将酶固定的MNPs在蛋白质溶液中孵育以进行酶解。方法B中将酶固定在MNPs的表面上有多种方法，最常用的技术是在酶和MNPs表面活性基团之间形成共价键（图2）。共价键法主要有：单层酶法；两步法（单层酶覆盖+酶交联），以毛状非交联聚合物链杂化MNPs为基质固定化酶法；另一种固定化技术是基于酶分子和MNPs的功能化表面之间的非特异性物理吸附。通常，在固定化过程完成之后，需要测量固定在MNPs上的酶的量或活性以评估固定化效率。在大多数情况下，固定化酶的量直接由酶溶液在与活化的MNPs孵育前后的吸光度（在280nm处）的减少来确定，并且对于单层共价键或传统的物理吸收，所确定的值在数十几ug/mg的水平（表1）。

图1. 基于MNP的蛋白酶解过程

图2. MNPs上酶固定化的制备过程示意图

表1 用于固定蛋白酶酶解的功能化MNPs列表

1.2、基于MNP的蛋白酶解

为了加速蛋白质的酶解，常常通过引入其他能量，包括：微波辐射、超声波能量和压力等。微波辐射已被广泛用于加速酶消化，与标准的溶液中过夜酶解法相比，可以在几分钟内获得等效的酶解效率。压力辅助酶解可以在室温下成功进行，这有利于限制归因于加热的化学产物。基于芯片/柱上的酶解可以将耗材和样品的数量减少几个数量级（图3）。板上酶解，作为最有吸引力的概念之一，可以加快蛋白酶解过程，并在进行MALDI-TOF-MS测量之前消除处理样品的需要。

图3. 功能化MNPs存在下蛋白质酶解过程示意图

2. 富集低丰度蛋白质/多肽的功能化MNPs

基于功能化MNPs在常规低丰度蛋白质/多肽富集过程中，低丰度蛋白质／多肽通常特异性吸附在上样缓冲液中的MNPs上，然后洗涤数次以除去非特异性吸附的物质，随后将捕获的蛋白质/多肽MNPs直接沉积在MALDI板上或从MNPs上洗脱蛋白质/多肽，通过质谱法分析低丰度蛋白质/多肽，并作以进行进一步分析。MNPs的高磁响应特性使得简单地施加外部磁场就可以方便地从样品或缓冲溶液中分离MNPs，这不仅促进和加速了整个富集过程，而且避免了高转速离心过程中大分子量物质的沉淀。表2中总结了近年来发表的用于富集低丰度肽/蛋白质的功能化MNPs。

表2. 用于富集低丰度肽/蛋白质的功能化MNPs一览表

N-烷基（C8-或C18-）链可以通过疏水相互作用有效富集肽或蛋白质。商用C8/C18功能化磁珠，尺寸相对较大(1-10 mm)，被广泛用于富集生物样品中的微量肽和蛋白质。商业化磁珠的表面通常由聚苯乙烯和丙烯酸烷基酯等有机聚合物组成，可能导致较低的生物相容性。商业C8功能化磁珠组成中无机磁珠含量非常低，因此磁响应相对较差(<30.0 emu g^-1)，导致较长的分离时间（每个分离过程5分钟）。基于这些特点，为了获得烷基官能化的MNPs具有大的表面积、良好的生物相容性和强的磁响应，作者研究团队展开了优化，研究出一些新的功能化磁珠。通过常规硅烷化方法与氯（二甲基）辛基硅烷反应C8基团在二氧化硅涂层的MNP表面被官能化(Fe₃O₄@SiO₂)（图4 A） 。获得的Fe₃O₄@SiO₂–C8 MNPs的直径和外壳厚度分别约为300 nm和60 nm，核壳微球中的磁铁矿含量增高，形成高磁饱和值高达65.5 emu g^-1。进一步简化通过一锅法合成程序制备获得的Fe₃O₄-NH2–C8 MNPs直径50nm，拥有比先前反应更大的相对表面积。为了进一步提高烷基官能化MNPs的生物相容性，提出了另一种合成方法，即在碳质多糖的MNPs磁珠上官能化C8(Fe₃O₄@C)（图4 C）。这些烷基官能化的MNPs已经广泛应用于蛋白质组学和肽组学研究。

图4. 烷基官能化MNPS的制备过程示意图

为了从复杂的生物样品中有效富集低丰度肽/蛋白质，还开发了制备用烷基以外的衍生物官能化的MNPs的方法。富勒烯(C60)功能化硅胶被证明在富集低浓度肽和其他生物分子方面具有极好的潜力。作者团队将C60引入到Fe₃O₄@SiO₂MNPs（图5 A），Fe₃O₄@SiO₂–C60 MNPs被成功应用于富集胰蛋白酶酶解产物和含有尿素和许多其他污染物的人类尿液中的低浓度肽的富集，也被证明能有效富集低浓度蛋白质。有机疏水性聚合物如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)也被证明是富集肽和蛋白质的强大吸附剂，采用类似于上述实验的改进过程，实现PMMA功能化MPS-modified Fe₃O4@SiO2 MNPs（图5 B）。 

图5 有效富集低丰度蛋白的不同MNP制备过程示意图

石墨烯(Graphene: GR)/氧化石墨烯(graphene oxide: GO)可以通过氢键和静电相互作用与蛋白质发生强烈相互作用，从而为蛋白质富集和检测提供高效的平台。GR和GO片通过共价键或静电组装被固定在二氧化硅NP、介孔二氧化硅复合材料、和SiO₂@PMMA NPs中，来促进对低丰度肽或蛋白质的提取。Fe₃O₄-R-LaPO₄亲和探针基于石墨烯作为载体的独特结构的疏水性不仅可以富集复杂生物样品中的低丰度肽，并且由于附着在石墨烯上的LaPO₄纳米棒的亲和力和水解催化作用，还可以选择性的吸附和方便的标记磷酸肽。这两种类型的肽可以被选择性地捕获，然后一个接一个地洗脱用于顺序MS检测。

在多肽组学研究中，当使用MNP富集内源性肽时，复杂生物样品（如组织、血清、尿液、唾液等）中的高丰度蛋白质会抑制内源性肽的吸附，导致肽对蛋白质的富集选择性降低。具有高度有序孔和高内表面积的介孔材料可以通过排除蛋白质在孔内表面的吸附来确保高选择性富集。作者团队开发了一种新的多肽富集方案，使用由Fe₃O₄@nSiO₂芯和垂直排列的中孔SiO₂壳（命名为Fe₃O₄@nSiO₂@mSiO₂）组成微球（图6 A）。通过使用微球富集标准肽，可以将S/N比提高100倍以上。研究者们进一步优化，获得Fe₃O₄@mSiO₂ 微球（图6 B）；也有研究者用无孔二氧化硅涂覆MNPs，然后在添加CTAB后将四乙氧基硅烷(TEOS)和正辛基三乙氧基硅烷(C8TEOS)一起添加，得到C8功能化的中孔二氧化硅壳（图6 C）。作者团队以表面活性剂（CTAB）为模板，TEOS和C8TEOS为前体，采用一锅溶胶-凝胶法制备了C8-Fe₃O₄@mSiO₂微球（图6 D）。

图6. 有效富集多肽的不同磁珠的制备过程示意图

除了上述综述的基于疏水相互作用或配位相互作用的MNPs可实现非选择性富集外，还有一些方法侧重于选择性富集某些含有特定或末端氨基酸的蛋白质或肽。例如利用二异硫氰酸盐或异硫氰酸酯偶联磁性纳米颗粒快速分离和鉴定蛋白质消化混合物中的N-封闭肽。

3. 磷酸化蛋白/磷酸化肽段富集的MNP

最常用的基于MNPs的富集磷酸化蛋白/磷酸化肽段方法是固定化金属离子亲和层析(IMAC)和金属氧化物亲和层析(MOAC)。磷酸肽上带负电荷的磷酸基团通过与带正电荷的物体相互作用提供了另外的富集磷酸肽的可能手段。前人开发了一种利用聚乙烯亚胺(PEI)修饰的MNPs作为亲和探针富集磷酸肽的新方法。

IMAC利用带正电荷的金属阳离子对带负电荷的磷酸肽的高亲和力，然后使用碱性水溶液进行洗脱。不同的金属离子（如Fe³⁺、Ga³⁺、Zr⁴⁺、Ti⁴⁺、Ce⁴⁺等）通过一些合适的螯合配体螯合到功能化MNPs的表面。固定金属离子的MNPs富集效率主要取决于三个部分：（1）金属离子的类型；（2） 螯合配体的类型；（3） MNPs的性质，如形态、粒度、表面积和孔隙率。表3总结了近年来发表的基于IMAC的用于富集磷酸肽/磷蛋白的功能化MNPs。

表3  基于IMAC的用于富集磷酸肽/磷蛋白的功能化MNPs一览表

作者团队将Fe³⁺和Ce⁴⁺通过亚氨基二乙酸(IDA)螯合固定在磁性二氧化硅微球上(Fe₃O₄@SiO₂)具有高磁响应性(Ms:68.2 emu g^-1)。采用不同的制备工艺将含磷酸基团的螯合配体功能化到MNPs表面，以实现Zr4⁺的配位结合和磷酸肽的选择性富集，结果表明磷酸螯合剂比IDA和NTA具有更高的亲和力，并且可以鉴定出更多的磷酸肽。

MOAC的最大优点是，与受到各种缓冲剂、洗涤剂和其他低分子量分子严重影响的传统IMAC相比，金属氧化物对生化和细胞生物学程序中通常使用的许多试剂更坚固和耐受。在基于MNPs的MOAC方法中，通过不同的合成过程，将各种金属氧化物(TiO₂、ZrO₂、Al₂O₃、ZnO、Ta₂O₅、Nb₂O₅、Ga₂O₃、SnO₂和CeO₂)涂覆在Fe₃O₄ MNP的变性表面上（图7）。在这些金属氧化物中，TiO₂因其突出的富集效果而最受欢迎。

图7 富集磷酸化肽段的不同MNP的制备过程流程图

4. 糖蛋白/糖肽的富集的MNP

常用的糖特异性富集方法是基于凝集素亲和层析、亲水相互作用层析(Hydrophilic-interaction chromatography, HILIC)、酰肼化学辅助固相萃取，近年来发表的基于上述原理的用于富集糖肽/糖蛋白的功能化MNPs总结在表4中。

基于HILIC的方法具有重复性好、选择性高、聚糖组成不可逆变化等优点，可用于糖肽的富集。常见的HILIC材料包括可从商业来源获得的硅氧烷、阳离子交换、阴离子交换、酰胺基、两性离子(ZIC)基和碳水化合物固定相。ZIC-HILIC已被证明比其他HILIC吸附剂对糖肽具有更好的亲水性相互作用。糖肽可以被氨基官能化的Fe₃O₄ MNPs直接捕获，而无需进一步的表面修饰。通过4-乙烯基-吡啶乙磺酸单体的自发酸催化聚合和ZIC聚合物在Fe₃O₄ MNPs上的静电吸附制备了ZIC-HILIC磁珠。所得到的磁性ZIC-HILIC MNPs被证明为从标准糖蛋白fetuin中富集糖肽提供了高特异性和高回收率(95–100%)。

氨基功能化的MNPs(Fe₃O₄–NH₂ MNPs)也可用于选择性富集磷酸肽和糖肽。通过磷酸阴离子和Fe₃O₄之间形成的桥接双齿结合，以及磷酸肽上带负电荷的磷酸基团和带正电荷的Fe₃O₄–NH₂ MNPs之间的静电相互作用，选择性富集了磷酸肽。在磷酸肽富集后的流出部分，通过聚糖链和Fe₃O₄–NH₂ MNPs之间的亲水性相互作用，在大多数有机溶液中富集了糖肽。

表4 糖蛋白/糖肽富集的MNP一览表

MNPs的表面功能化和修饰以实现新的功能性得到了越来越多的关注。具有设计活性位点的多功能MNPs，包括酶、配体、金属氧化物或其他物质，被证明可以极大地提高蛋白质消化和富集低丰度肽/蛋白质的效率。为了增加功能化MNPs的活性位点，可制备尺寸较小的MNPs为活性位点结合提供更大的表面积；或者在MNPs表面涂覆聚合物，或者选择与其他可以提供更大表面积的组分形成MNPs的纳米复合材料，如沸石、中孔二氧化硅、中孔金属氧化物、或石墨烯(GR)/氧化石墨烯(GO)。开发简单的合成途径来制备具有更高磁响应性和生物相容性、更多用于酶固定或肽/蛋白质捕获的活性位点以及多功能的MNPs仍将是一个活跃的研究领域。此外，因为有磁芯，酶解和富集，可以使用机器人系统实现自动化，将消化和富集过程中的处理误差降至最低。目前基于MNPs进行高通量酶解或富集只有少数使用了自动化平台，因此这仍然是一个特别具有挑战性的事情，值得深入研究。