马铃薯作为世界第四大粮食作物，在保障人类粮食供应稳定方面发挥着重要作用。然而，由致病性链霉菌(Streptomyces)引起的马铃薯普通疮痂病(common scab, CS)在全球范围内均有发生，且危害逐年增加。
近日，中国科学院微生物研究所仲乃琴研究团队在Science Bulletin期刊发表文章"Phosphorus accumulation aggravates potato common scab and to be controlled by phosphorus-solubilizing bacteria"，本研究发现磷肥施用量与疮痂病危害程度高度相关。磷素在土壤中大量沉积不仅诱发致病性链霉菌的快速繁殖，也显著降低了拮抗菌的丰度和拮抗功能。本研究百趣生物提供发现代谢组学（现已升级为新一代代谢组学NGM）技术服务。
已有研究表明，马铃薯CS病可能受到包括外源施肥在内的植物矿质养分的影响，氮、磷、钙、铁等宏微量元素在土壤或植物组织中的含量不同，影响CS的严重程度。磷是所有作物生长发育所必需的营养元素，通常通过施用磷肥来供给。由于土壤胶体对磷具有较强的吸附和固定作用，大多数磷肥（磷酸一铵和磷酸二铵）与土壤中的Ca2+、fe2+、fe3+和Al3+结合形成不溶性磷酸盐，包括Ca3(PO4)2。本研究首次发现Ca3(PO4)2能促进疮痂链霉菌(S. scabies)的生长和繁殖。病原菌在生长过程中产生有机酸，有机酸释放的质子与Ca3(PO4)2结合形成(HPO4)2-，能促进S. scabies的生长。本研究进一步筛选了一种具有有效溶磷功能的拮抗细菌，以有效防治马铃薯CS。
1、田间试验
本研究于2020-2021年在广东省惠东(HD)和2021年在内蒙古自治区海拉尔(HLE)两个主要马铃薯品种（Favorita和Qingshu）上进行田间试验，研究土壤磷含量对CS发育的影响。发现发病率和指数与磷浓度呈正相关，与低磷肥(LP)或中磷肥(MP)相比，高磷肥(HP)提高了CS的发病率和指数。与此一致的是，由S. scabies效应基因txtA基因的DNA水平所表明的S. scabies在土壤中的相对丰度在HP中也高于LP（图1）。这些结果表明，磷肥用量与田间CS的发生呈正相关。
2、培养基实验
鉴于磷肥能够促进田间CS的发生，在培养基（初始pH7.0）中添加各种类型的磷化学成分以支持S. scabies生长来进一步探索哪些磷酸盐状态有助于这一结果。发现在一定程度上H2PO4可促进S. scabies的生长，而过量的H2PO4对S. scabies的生长没有好处。而(HPO4)2-容易被S. scabies吸收利用，可持续促进S. scabies的生长。不溶性Ca3(PO4)2可促进S. scabies快速生长和繁殖，而K3PO4的效果不像Ca3(PO4)2那样明显（图1 b）。 使用扫描电镜观察S. scabies的生长情况。发现在没有Ca3(PO4)2的情况下，第1天只有少数S. scabies孢子萌发形成气生菌丝，而在2.5 g/L Ca3(PO4)2的情况下，所有孢子都形成了菌丝。在Ca3(PO4)2浓度为5 g/L的条件下，气生菌丝产生分支，表明Ca3(PO4)2促进了S. scabies孢子萌发和菌丝生长（图1 c）。在第3天，2.5 g/L Ca3(PO4)2促进菌丝生长和繁殖，菌丝强度显著提高。当Ca3(PO4)2增加到5 g/L时，大量新孢子形成。综上所述，Ca3(PO4)2促进S. scabies的快速生长和繁殖。田间试验结果也表明，随着Ca3(PO4)2的增加，CS严重程度显著加重（图1 d）。 图1.高磷肥的施用增加了马铃薯CS病的严重程度
3、Ca3(PO4)2促进S. scabies生长和繁殖的机制研究
为了进一步揭示Ca3(PO4)2促进S. scabies生长和繁殖的机制，本研究对培养基的pH和代谢产物进行了分析。确定S. scabies生长的最佳初始pH值为7.0（图1 e），添加Ca3(PO4)2 （2.5 g/L或5 g/L）后，培养基酸化，36h后pH降至6.0以下（图1 f，左图）。通过高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)对代谢产物分析表明，与不含Ca3(PO4)2的培养基相比，含Ca3(PO4)2的培养基中丙酮酸、吡咯-2羧酸、L-亮氨酸和对苯甲酸等有机酸水平升高（图1 f，右图），推测这些有机酸是否将H+赋予Ca3(PO4)2并生成(HPO4)2-促进S. scabies孢子萌发和菌丝生长。为了验证这一假设，本研究使用x射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)分析培养基中的磷酸盐含量，发现在含有Ca3(PO4)2但不含S. scabies的培养基中，Ca3(PO4)2和(PO4)3-被检测到。而接种S. scabies使主要磷酸盐变为(HPO4)2-（图1 g）。同时，含有Ca3(PO4)2的培养基中S. scabies孢子的萌发数量高于含有CaHPO4的培养基（图1 b）。这表明(HPO4)2-可以促进孢子萌发。同时，培养基中的Ca3(PO4)2促进菌丝生长（图1 c）。这些结果证实了上面的推测。
4、鉴定S. scabies拮抗菌
对中国不同马铃薯产区的土壤样本进行多轮筛选，共分离出988株具有抗S. scabies能力的菌株。其中芽孢杆菌所占比例最大，约为77%；假单胞菌占8.62%（图2 a）。这些拮抗细菌在疾病防治方面具有应用潜力。采用高通量测序方法分析了LP、MP和HP对土壤细菌组成的影响。具有潜在抗菌活性的两个属（芽孢杆菌和假单胞菌）的相对丰度随着磷肥用量的增加而显著降低（图2 b）。每个样本（LP、MP和HP）平均包含79,857个reads，与大约1843个分类操作单元(operational taxonomic units, OTUs)相匹配。 接下来从拮抗菌株中，选择拮抗效果最好的芽孢杆菌的3株拮抗菌株DX-9、XJ-3和HZ-9，以及假单胞菌的1株拮抗菌株SC-2进行后续实验，发现补充Ca3(PO4)2以剂量依赖的方式缩小了它们的抑制区（图2 c）。研究抑制率与Ca3(PO4)2浓度的关系（图2 d），发现随着Ca3(PO4)2浓度的升高，拮抗菌的抑制率降低。这些结果表明，高浓度Ca3(PO4)2可降低有益菌对病原菌的拮抗作用，这有利于S. scabies的生长和繁殖。
5、溶磷细菌筛选
为了验证是否可以通过降低土壤中Ca3(PO4)2的浓度来控制CS病，本研究进行了溶磷细菌筛选。将拮抗效果最好的4株菌株接种到溶磷培养基中，选择平板上的透明圈作为溶磷菌。然后从筛选的细菌中选择1株增磷菌株DX-9和2株非增磷菌株XJ-3和HZ-9进行盆栽实验。与未经处理但接种了S. scabies链球菌的马铃薯相比，所有细菌处理过的马铃薯的CS发病率和严重程度都要低得多（图2 e）。DX-9处理组的疾病指数明显低于XJ-3和HZ-9处理组（图2 e）。在Ca3(PO4)2培养条件下，Ca3(PO4)2被DX-9分解成(HPO4)2-和H2PO4，XJ-3培养后，培养基中含有Ca3(PO4)2和(PO4)3-，这与未培养细菌的对照组(Ctrl)的成分一致（图2 f）。通过扫描电镜观察到在含Ca3(PO4)2的培养基中，S. scabiess和DX-9可能相互竞争以获得更好的生长条件（图2 g），表明具有溶磷功能的拮抗芽孢杆菌对马铃薯CS的防治效果较好。
6、田间试验
用DX-9在HLE和HD的农场进行了田间试验发现：与对照相比，施用DX-9的田间病害发生率和病害指数均显著降低（图2 h-k），相应的，处理后田间管材产量显著提高（图2 i）。田间试验表明，DX-9可用于大规模生产中防治CS，提高马铃薯产量。 图2.磷酸盐增溶菌比非磷酸盐增溶菌更有效地抵消CS
本研究发现S. scabies分泌的有机酸可以在含有不溶性Ca3(PO4)2的条件下生长，这是由于S. scabies分泌有机酸，将不溶性Ca3(PO4)2分解成(HPO4)2-。本研究筛选出一株增磷菌Bacillus sp. DX-9，经田间试验证明其对CS病有拮抗作用。其主要机制可能与细菌对不溶性Ca3(PO4)2的释放和积累的增磷能力有关，并与S. scabies在生长和吸收磷方面展开竞争。因此，认为芽孢杆菌DX-9对马铃薯CS具有较高的抗性，适合在马铃薯生产中大规模应用。
