文章标题：Rice roots recruit Bacillus via the secretion of heptadecanoic acid
发表期刊：nature plants
影响因子：15.0
合作单位：南京农业大学
百趣提供服务：GC非靶标代谢组学、游离脂肪酸高通量靶标定量
研究背景
植物会主动招募有益根际微生物来增强自身免疫力，但其分子机制尚不明确。本研究阐明了水稻在稻瘟病发生时，经OsMKK4-OsMPK6-OsWRKY通路激活脂肪酸合成关键基因——OsKCS2，促使根系分泌十七烷酸招募根际芽孢杆菌。施加十七烷酸可重现芽孢杆菌的招募过程并提升水稻抗稻瘟能力。本研究完整揭示了地上免疫信号远程调控根际有益菌群的分子机制，为水稻病害绿色防控提供基因靶点与代谢调控思路。
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研究结论
01.根际芽孢杆菌增强水稻对稻瘟病的抗性
稻瘟病在全球范围内大幅降低了水稻产量，本研究在我国吉林、江苏、福建等典型重灾区展开了田间调查（图1a-b），并采集了健康存活株(S)和重病株(D)的根际土壤做16S rRNA测序以获得其细菌属水平的物种组成（图1c）。研究对比了三块田里健康株的芽孢杆菌占比，发现发病田中芽孢杆菌在存活株水稻根际显著富集（图1d-e）。为探究稻瘟病菌侵染过程中芽孢杆菌富集的分子机制，研究做了盆栽实验：对照组喷无菌水，实验组接种稻瘟菌，分别在接菌48h测叶片转录组、21天测根际微生物（图1f）。转录组结果表明，稻瘟菌处理组较对照上调了2094个基因（图1g），上调基因在MAPK信号通路富集最显著，该通路可能响应了稻瘟侵染（图1h）。16S rRNA结果表明，接种稻瘟病菌后芽孢杆菌丰度占比明显升高，多种芽孢菌含量大幅提升（图1i-j）。研究对差异基因和差异菌群做相关性分析，发现OsMKK4、OsMPK6两个MAPK基因与芽孢杆菌丰度呈显著正相关（图1k-l）。研究从水稻根际分离500种细菌，测序鉴定得到21种芽孢杆菌（图1m）制得芽孢杆菌的LB培养基，每3天浇灌幼苗，14天后接种稻瘟病菌（图1n），发现芽孢杆菌使叶片病斑显著减少，说明芽孢杆菌可增强水稻对稻瘟病的抗性（图1o-p）。
图1.芽孢杆菌增强水稻对稻瘟病的抗性
02.OsMKK4-OsMPK6模块调控根际芽孢杆菌丰度
基于OsMKK4和OsMPK6表达量的正相关性及芽孢杆菌富集情况，研究推测OsMKK4-OsMPK6信号模块调控根际芽孢杆菌的招募（图2a）。在OsMKK4突变株中，根际芽孢杆菌的丰度降至野生株(NIP)的64%（图2b-c），且多种芽孢杆菌菌种的丰度都显著下降（图2 d），OsMPK6突变株也表现出一样的情况（图2e-g），这些结果表明，OsMKK4作用于OsMPK6的上游，形成了一个对根际芽孢杆菌富集至关重要的信号模块。研究将激活环中保守的丝氨酸和苏氨酸残基突变为天冬氨酸18，构建了OsMKK44(DD)的组成型活性形式（简称为DD）（图2h）。将DD幼苗根浸泡在地塞米松(DEX)中诱导OsMKK4(DD)的表达，进而使OsMKK4(DD)对OsMPK6进行磷酸化（图2i）。随后，研究比较了经DEX处理24h的DD植株(DD_24h)与感染稻瘟病菌48h的野生型(MO_48h)叶片的转录组，鉴定出787个共同上调的基因（图2j-k），这些基因中有6.4%编码转录因子，包括bHLH、ERF、MYB、NAC和WRKY家族（图2l）。WRKY家族是数量最多的亚组，占所有转录因子编码基因的28%（图2m）。在鉴定出的50个转录因子中，OsWRKY70的诱导水平最高（图2n）。系统发育分析表明，OsWRKY70与OsWRKY24和OsWRKY53同源（图2n）。鉴于MAPK信号通路通常通过磷酸化下游转录因子发挥作用，这表明OsWRKY53/24/70在OsMPK6下游发挥关键的调控作用。
图2.OsMKK4-OsMPK6正调控根际芽孢杆菌的丰度
03.OsWRKY53/24/70作用于OsMKK4-OsMPK6下游调控根际芽孢杆菌的丰度
研究假设OsMKK4-OsMPK6级联反应通过磷酸化下游WRKY转录因子，尤其是OsWRKY70，来调控根际芽孢杆菌的募集（图3a）。为进一步验证它们与OsMPK6的相互作用，研究在水稻原生质体中进行了双分子荧光互补实验，结果进一步表明，OsWRKY蛋白与OsMPK6在细胞核中存在强烈的相互作用（图3b）。同时，RT-qPCR结果显示，与野生株相比，Osmpk6突变体中OsWRKY24、OsWRKY53和OsWRKY70的转录本水平显著下调（图3c）。研究对比野生型和Oswrky24 wrky53 wrky70三纯合突变体的α-多样性（图3d），表明WRKY家族缺失破坏了根际微生物稳态，且此突变体根际芽孢杆菌占比和丰度明显下降（图3e-h）。研究筛选出DD_24h、MO_48h和Oswrky24 wrky53 wrky70突变体中共有的54个差异表达基因（图3i），这些基因在突变体中表达显著下调，而在DD_24h、MO_48h中表达显著上调。对这54个基因进行的KEGG富集分析显示，其参与的通路包括脂肪酸延长、氨基糖与核苷酸糖代谢，以及多种植物次生代谢物的生物合成（图3j）。研究对三种不同植物的根际土壤做非靶代谢组分析：(1)健康植株与严重感染稻瘟病菌的植株；(2)Osmpk6突变体与野生型植株(ZH11)；(3)Oswrky24 wrky53 wrky70突变体与NIP（图3k）。通过差异分析发现，感染稻瘟病菌的Osmpk6和Oswrky24 wrky53 wrky70突变体根际中，两种长链脂肪酸—十七烷酸和棕榈酸的含量均下调（图3l-m）。以上结果表明，OsMKK4–OsMPK6–OsWRKY24/53/70级联反应可能通过调控水稻根际中长链脂肪酸的合成来促进芽孢杆菌的招募。
图3.OsMKK4-OsMPK6-OsWRKY53/24/70通过调控长链脂肪酸的合成来调控根际芽孢杆菌的丰度
04.OsKCS是OsMKK4-OsMPK6-OsWRKY24/53/7级联反应的下游基因，通过长链脂肪酸调控根际中芽孢杆菌的募集
上述结果表明，OsMKK4-OsMPK6-OsWRKY24/53/70信号级联参与长链脂肪酸的积累（图4a）。转录组数据显示，DD_24h、MO_48h和Oswrky24 wrky53 wrky70突变体中，脂肪酸延长通路均有富集；在54个显著差异表达的基因中，OsKCS2(LOC_Os02g11070)编码KCS酶（脂肪酸链延长过程中的关键限速酶）。此外，对OsKCS2启动子的分析发现，在起始密码子上游2270 bp的区域内存在多个W-box基序，这是WRKY蛋白的经典结合位点（图4b）。随后，研究通过酵母单杂交(Y1H)实验证实OsWRKY24/53/70能直接结合OsKCS2的启动子序列（图4c）。为探究OsWRKY24、OsWRKY53和OsWRKY70对OsKCS2转录调控作用，研究开展了双荧光素酶实验（图4d）：将35S::OsWRKY和ProOsKCS2::LUC构建体共转染至本氏烟叶片中获得相对荧光素酶活性，与共转染空载体对照相比，ProOsKCS2::LUC报告基因的活性显著升高（图4e），表明OsWRKY24/53/70可通过结合W-box基序促进OsKCS2的转录，说明OsKCS2是这些转录因子的直接靶基因。RT-qPCR结果显示：Osmkk4敲除突变株中OsKCS2表达量显著低于野生株；Osmpk6弱突变株中OsKCS2转录水平大幅下调；Oswrky24 wrky70 wrky53三敲除株中OsKCS2表达显著降低；DEX诱导OsMKK4(DD)激活植株中OsKCS2表达量显著高于空载对照（图4f），说明MAPK-WRKY通路正向调控OsKCS2转录。对比菌群组成，Oskcs2突变后芽孢杆菌占比明显下降，野生株根际芽孢杆菌占比远高于Oskcs2突变株（图4g-i），证明OsKCS2缺失直接抑制芽孢杆菌在根际定殖。与野生株比，Oskcs2突变株根系分泌的十七烷酸含量显著降低、棕榈酸下调幅度微弱，说明OsKCS2主要特异性调控十七烷酸合成（图4j）；向土壤外源添加十七烷酸，可显著恢复根际芽孢杆菌丰度，增强水稻的稻瘟病抗性，证明十七烷酸是介导芽孢杆菌招募的关键下游代谢信号（图4k-n）。
图4.OsMKK4-OsMPK6-WRKY模块通过转录激OsKCS来增强根际芽孢杆菌的定殖，OsKCS可调控十七烷酸的合成
研究总结
本研究完整阐明了水稻应对稻瘟病的防御通路：稻瘟侵染激活叶片OsMKK4-OsMPK6激酶级联，MPK6磷酸化OsWRKY24/53/70；三类转录因子直接结合脂肪酸合成基因OsKCS2的W-box元件并激活其表达，促进根系分泌十七烷酸。外源回补试验证实十七烷酸可定向富集根际芽孢杆菌；缺失通路任一关键基因均会降低十七烷酸含量与芽孢丰度。芽孢杆菌复合菌群或外源十七烷酸均可显著减轻水稻稻瘟病。本研究揭示了由免疫信号调控根系特征代谢物、重塑根际有益菌群的分子机制，为水稻绿色抗病育种与生防制剂开发提供靶点与理论依据。
