标题：Untargeted metabolomics revealed the metabolites profile and conjugated linoleic acid formation mechanisms of fermented milk produced by novel Limosilactobacillus fermentum L1

发表期刊：LWT

影响因子：6.6

合作单位：云南农业大学

百趣提供服务：新一代代谢组学NGM 2 Pro

研究背景

本文探究新型发酵乳杆菌L1对共轭亚油酸(Conjugated Linoleic Acid, CLA)形成机制的影响，并对CLA发酵乳中的代谢产物指纹图谱进行研究。结果表明，添加L1后，发酵乳的理化性质、质地和风味均得到改善，CLA含量最高可达814.26 μg/g，代谢物组学分析表明，共鉴定出4241种差异代谢产物，包括脂肪酸、氨基酸及其衍生物、有机酸等。KEGG富集分析表明，亚油酸(Linoleic Acid, LA)在脂肪酸代谢和L1的转化功能中发挥核心作用。L1发酵乳的特征指纹图谱包括脂肪酸、氨基酸、有机酸、生物碱和木脂素，分别占42.86%、34.13%、9.52%、8.73%和4.76%。本研究为发酵食品的功能性营养研究提供了理论依据。

研究结论

01.L1发酵乳与红花籽油发酵乳的品质特性

为了研究新型发酵乳杆菌L1对发酵乳理化性质的影响，以不添加油脂和发酵乳杆菌L1的发酵乳作为对照组，在相同工艺条件下对三种发酵乳进行加工。结果发现（表1），随着培养时间的增加，pH值逐渐降低。此外，由于发酵过程中有机酸发生积累，发酵乳的可滴定酸度随着发酵时间的增加而逐渐增加，当发酵时间大于20 h 时，3种发酵乳的TA大于120°T，pH小于4.2。此外，3种发酵乳中活菌数均超过10⁸ CFU/mL，其中L1组活菌数最高（10¹⁰ CFU/mL），CLA的含量显著高于SO组，说明发酵乳中添加发酵乳杆菌L1能显著提高共轭亚油酸的含量（表1）。

表1.不同发酵时间的滴定酸度、pH和共轭亚油酸浓度

在发酵20 h和冷藏(4 ℃，24 h)后，SO和L1组的凝胶强度、粘稠度、持水性、组织状态和润滑性评分与对照组相比更高（表2）。乳制品的质地与脂肪酸有关，添加脂肪后，发酵乳呈乳脂状，内聚性和粘度增加，产品口感更好，质地更润滑。当添加脂肽后，发酵乳风味成分含量增加、稳定性和持水性提高。发酵乳中的乳清蛋白可以通过氢键、疏水相互作用和二硫键与酪蛋白结合从而使结构更加致密、稳定，并产生多孔，多孔的水分损失会随着发酵乳中油脂含量的增加而减少，因此可以维持小油滴。有研究使用3种LAB生产发酵乳，结果表明，发酵乳杆菌LA3改善了发酵乳的质地特性和风味特性，比如硬度、粘稠度、香气、口感和丝滑程度等，与本研究结果一致（图1）。

表2.不同种类发酵乳的质地和可见计数

图1. 不同发酵乳的感官评价

02.发酵乳杆菌L1和红花籽油对发酵乳的影响

利用PCA对L1组、SO组和对照组的样本代谢数据分布进行研究，结果表明同组样本之间重复性较好，三组之间有显著差异（图2A）。在L1组和对照组中共鉴定出4241种代谢物，与对照组相比，L1组显示出1970种代谢物上调，2271种代谢物下调；SO组与对照组相比，2045个代谢物上调，2663个代谢物下调；与SO组相比，L1组中有1038种代谢物上调，1149种代谢物下调（图2B-D）。为分析发酵乳杆菌L1产生的关键代谢物，研究对差异代谢物进行分类，将所有代谢物分为35类。与对照组相比，L1组中脂肪酸（54种）、氨基酸及其衍生物（43种）、有机酸（12种）、生物碱（11种）、木脂素（6种）等亚类（5种以上）的含量明显增加。

图2.主成分分析得分散点图及差异代谢物火山图

03.富含CLA的发酵乳中的关键代谢物及其代谢途径

添加油脂后，SO组和L1组的脂肪酸相关代谢通路被激活，可能涉及微生物生物合成和底物可用性的多方面机制。研究表明，富含LA的红花籽油可以通过烯醇化酶的作用促进发酵乳杆菌L1在发酵过程中将LA转化为CLA（图3）。整合通路图可以看出，这些代谢途径的中心是LA，属于n-6脂肪酸家族，具有改善血脂、胰岛素抵抗等功能。而CLA是LA的异构体，关于CLA的研究大多数集中在肥胖相关方向上。对几种不同脂肪含量的市售发酵乳中的共轭亚油酸含量进行研究，发现每100 g全脂发酵乳的CLA含量为10.42-25.63 mg，低脂发酵乳为10.42-25.63 mg，而每100 g样品中CLA含量高达3.96 mg。综上，发酵乳的CLA含量与原料乳和发酵剂的脂肪含量相关。

图3.富含CLA的发酵乳中脂肪酸相关代谢通路

为进一步验证红花籽油和发酵乳杆菌发酵乳中CLA的含量，对发酵乳中的脂肪酸进行定量分析。结果发现，含有红花籽油和发酵乳杆菌L1的L1组的CLA含量显著高于仅含有红花籽油的SO组；SO组的LA含量显著高于L1组，进一步证实L1能促进红花籽油中的亚油酸转化为CLA。L1组与对照组相比，柠檬酸循环、乙醛酸和二羧酸代谢、抗生素生物合成、氧代羧酸代谢通路中富集到一些差异显著的有机酸，SO组与对照组相比，也富集到相同的代谢通路（图4）。三个样品的TA和苹果酸含量的趋势相同，对照组的TA和苹果酸含量最高，SO组次之，L1组的苹果酸和TA含量最低。L1组发酵20 h的样品感官评分最高，TA和pH值分别为121.50和4.02，这归因于苹果酸使产品具有独特的酸味，而添加红花籽油和发酵乳杆菌L1使脂肪发生代谢分解，产品质地更好。细菌的代谢活动离不开能量的支持，而有机酸（包括苹果酸）是TCA循环的重要底物，TCA循环产生的ATP为不饱和脂肪酸和脂肪酸的生物合成提供能量，表明苹果酸为其他代谢提供能量，因此L1组TA含量小于其他两组。

图4.富含CLA的发酵乳中有机酸相关代谢通路

L1组和SO组与对照组相比，氨基酸(AA)差异显著，可分为12种。发酵乳杆菌L1发酵后，AA谱发生了变化，AA具有调节代谢途径、预防和治疗代谢疾病等功能。在本研究中，在L1组中发现了11种生物碱，生物碱在植物中分布广泛，由于其具有抗癌和抗氧化等多种功能，已被用于医疗保健产品中。木脂素主要存在于植物中，具有抗癌、抗氧化等多种功能，在L1组中检测到6种木脂素。其中，4-羟基肉桂酸、邻香豆酸和香豆酸可归为肉桂酸。肉桂酸主要从肉桂树皮中提取，因其良好的风味而被广泛应用于食品工业。肉桂酸及其衍生物被报道可有效治疗癌症、细菌感染，对金黄色葡萄球菌也有很强的抑制作用。

04.CLA的形成机理

为了进一步分析发酵乳中添加L1和红花籽油对脂肪酸代谢的影响，对发酵乳中的脂肪酸进行了定量分析。SO组和L1组的脂肪酸中，以肉豆蔻酸、棕榈酸、LA和CLA为主，表明C∶16和C∶18所占比例较高。红花籽油的主要脂肪酸为棕榈酸、LA和CLA，由于添加了红花籽油，本研究中SO组和L1组样品中的主要脂肪酸为棕榈酸、LA和CLA。与SO组相比，L1组CLA值升高，LA含量降低。亚油酸异构酶(LAI)的酶系包括烯醇化酶(eno)和肌球蛋白交叉反应抗原(MCRA)在某些细菌中负责将油酸或LA转化为CLA。先前研究发现，当LA作为底物时，发酵乳杆菌L1的感受系统被激活，导致eno表达增加，CLA含量也增加。因此，发酵乳杆菌L1转化CLA的能力可能归因于烯醇化酶的作用。红花籽油的添加激活了亚油酸的代谢途径，改变了多种代谢产物的价值，使发酵乳具有良好的风味和质地（图5）。此外，红花籽油富含LA，发酵乳杆菌L1具有将LA转化为CLA的能力，因此L1组的CLA值高于其他两组，可以利用CLA生成菌生产富含CLA的发酵乳。

图5.发酵乳杆菌L1在富含CLA的发酵乳中形成共轭亚油酸的分子机制

05.CLA发酵乳的特征指纹图谱

使用富含CLA的发酵乳中的代谢物（超过5个亚类）构建代谢物指纹图谱（图6），结果发现，脂肪酸类、氨基酸类、有机酸类、生物碱类和木脂素类化合物分别占42.86%、34.13%、9.52%、8.73%和4.76；脂肪酸主要由CLA、LA等组成；氨基酸由甘氨酸、谷氨酸等12种物质组成；有机酸主要由谷氨酸、L-苹果酸、酮亮氨酸等组成；生物碱主要由次黄嘌呤、咖啡因和甜菜碱组成；木脂素主要由N-阿魏酰-1，4-丁二胺、肉桂酸组成。表明样本中含有丰富的功能性营养素，单一营养素主要可以用于预防某些疾病，但对慢性疾病如II型糖尿病无效。单一营养素与发酵乳一起食用时，对于减肥的积极作用增加，因此人们越来越重视和认识食物的重要性而不是单一的营养素。发酵乳作为一种独特的食品，富含多种营养和益生菌，有利于营养吸收和消化。利用气相色谱-质谱联用技术对干酪中的挥发性成分进行分析，并探究非发酵剂乳酸菌对干酪成熟过程中风味的影响。研究发现，风味化合物和气味特征存在显著差异。采用液相31 P核磁共振技术对4种不同市售婴幼儿奶粉中磷脂含量进行探究，发现部分品牌的磷脂酰乙醇胺和螺磷脂含量较低。由于原料乳、发酵工艺和发酵剂的变化，乳制品的特征代谢物也有所不同，因此，通过构建产品的特征代谢物指纹图谱，可以全面了解其营养特征，便于消费者合理选购产品。

图6.富含CLA发酵乳功能性成分的指纹图谱

研究总结

结果表明，发酵乳杆菌L1能改善发酵乳的CLA值、质地和风味，将LA转化为CLA，提高CLA含量。通过代谢组学技术，发现CLA发酵乳富含氨基酸、有机酸、生物碱和木质素，进一步构建指纹图谱以揭示发酵乳的代谢特征。综上，本研究为乳酸发酵食品的生产和益生菌的综合利用提供理论依据，具有一定的创新性和广阔的应用前景，未来可聚焦于探究乳酸菌对人体健康的影响上，例如CLA生物利用度、生理影响、长期安全性等，进而最大限度地提高转化价值，应用于实际生产中。