期刊：Phytomedicine
影响因子：6.7
合作单位：安徽大学
百趣提供服务：胆汁酸高通量靶标代谢组学
非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一个主要的临床和全球公共卫生问题，目前尚无特定的药物治疗，也缺乏批准用于NAFLD临床治疗的药物。现如今，科学家们越来越关注饮食疗法来管理NAFLD，强调天然成分如多糖、多酚、黄酮和生物碱的作用。有研究表明，黄茶(Yellow tea, YT)在治疗代谢疾病中发挥重要作用，经过特殊加工步骤后，表儿茶素的水平降低，而茶多糖的水平显著增加，黄茶多糖(Yellow tea polysaccharides, YTP)可以通过调节巨噬细胞的M2极化和肠道微生物群来预防肥胖。作者先前有进行过相关研究，证明YTP的抗氧化和抗炎特性具有肝保护效益。然而，将YTP与肠道微生物群在胆汁酸代谢或个体中联系起来的研究很少报道。因此，作为以前工作的补充，本研究通过胆汁酸高通量靶向代谢组学和16s高通量测序技术，着重于调查胆汁酸代谢物与肠道微生物群之间的关系，并确定它们的宿主靶点，以评估YTP对NAFLD的影响。
从4个不同的组分中分离纯化得到YTP2多糖，通过多种分析技术（如PMP前柱衍生化、HPLC-DAD分析、FT-IR光谱测定和SEM等），对其化学组成、官能团、单糖含量、分子结构和形态进行了详细的研究（图1A-F）。研究结果表明YTP2是一个主要由甘露糖和半乳糖酸组成的酸性多糖，且具有复杂的分子结构。
图1. YT多糖的理化性质分析
为了评估YTP2对NAFLD模型的潜在治疗作用，研究选择NAFLD小鼠，分别进行YTP2或OBA（一种治疗非酒精性脂肪肝的药物）补充剂治疗，持续12周后进行观察。观察结果发现，YTP2补充剂可以显著减少高脂饮食小鼠的体重增加，改善食欲下降，减少肝脏中的脂质沉积、炎症细胞浸润和纤维化损伤（图2A-C）。此外，YTP2和OBA治疗还减少了肝组织中巨噬细胞的浸润，降低了血清和肝脏中的甘油三酯、总胆固醇、谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平（图2D-P）。
图2. YTP2对NAFLD小鼠血脂的影响
使用商业检测试剂盒对血液、肝脏和粪便样本中的总胆汁酸(Total bile acids, TBA)水平进行检测，结果显示，YTP2的干预可以调节血清和粪便中的BA水平，改善由高脂饮食引起的BA代谢紊乱。采用UPLC-MS/MS技术检测不同饮食模式下小鼠结肠中BA代谢物的水平，R2X, R2Y和Q2值揭示了不同处理模式下小鼠结肠样品中BA组成的显著变化。通过提取OPLS-DA的VIP值并计算差异倍数来确定各组之间的差异BA，其中在HFD和Chow组之间共鉴定出22种差异BA代谢物，在YTP2与HFD组之间共鉴定出16种差异BA代谢物。
图3. 胆汁酸高通量靶向检测与分析
通过胆汁酸高通量靶向检测对肠道内容物中BA的组成进行分析，发现高脂饮食导致未结合型和次级胆汁酸增加，而结合型胆汁酸减少。YTP2的干预能够通过提高结合型胆汁酸的水平来改善这一现象，并且YTP2-H组在结肠中初级胆汁酸的水平也有增加。此外，YTP2-H组还显著提高了结合型与未结合型胆汁酸的比率，并降低了次级胆汁酸的水平，这可能对改善NAFLD有积极作用。
图4. 肠道内容物中BA的组成成分分析
基于YTP2干预对BA代谢的有效调控，采用RT-qPCR和Western blots对肠肝循环中BA代谢相关基因和蛋白表达进行验证。研究发现，与Chow组相比，高脂饮食组的FXR、FGF15、ASBT、Ibabp、Ost-α和Ost-β mRNA表达显著下降，而高剂量YTP2补充显著逆转了这些变化。此外，对肝脏BA合成有关的酶和基因也进行了分析（图5B），发现YTP2干预还影响了肝脏中与胆汁酸合成和转运相关的基因表达，并且这种影响在蛋白质水平上也得到了体现，除了Cyp7a1和Cyp27a1不存在剂量依赖性之外，其余各组间BA代谢蛋白表达变化趋势与mRNA表达水平一致。
图5. 肠肝循环中BA代谢相关基因和蛋白的表达验证
由于肠道菌群在NAFLD的发展进程中起着关键作用，研究进行了16s测序与分析，以评估多糖对肠道菌群的影响。α多样性分析显示，YTP2补充能够增加α多样性指数（Chao1、Observed、Goods和Simpson）。基于UniFrac距离的主坐标分析(PCoA)揭示了各组肠道微生物群落之间不同的聚类模式，HFD和YTP2处理均导致微生物群落结构发生显著变化（图6C）。通过LEfSe分析，作者还发现了不同饮食处理组之间在特定微生物分类群的丰度上的差异。如Chow组显示了较高丰度的s_Lactobacillus_taiwanensis和f_Peptostreptococcaceae。相反，HFD组显示出p_Firmicutes和g_Turicibacter的丰度增加。相比之下，YTP2-L干预显著增加了c_Alphaproteobacteria、s_Lactobacillus_oris和g_Saccharimonadaceae_unclassified的丰度，而YTP2-H干预则提高了p_Bacteroidetes、c_Bacteroidia、_desulfovibrionaceae、c_Deltaproteobacteria和_desulfovibrionales的丰度。
图6. YTP2对NAFLD小鼠肠道菌群的影响
相对丰度柱状图展示了YTP2干预对肠道菌群结构的影响（图7）。门水平的结果表明，YTP2干预可能导致Bacteroidetes的增加和Firmicutes的减少。此外，YTP2干预还影响了特定属水平上的微生物类群，包括Lactobacillus丰度的降低，以及对胆盐水解酶产生菌的影响，如Streptococcus和Clostridium，与Chow组相比，Streptococcus和Clostridium在HFD组中的表达受到抑制。
图7. YTP2干预对肠道菌群结构的影响
胆盐水解酶由微生物群落产生，能够将甘氨酸或牛磺酸结合型胆汁酸分解为未结合型胆汁酸。因此，研究针对特定属与胆汁酸进行了关联分析，以寻找可能有助于改善失调的BA代谢物。结果显示Muribaculaceae、Pseudomonas和acterium_coprostanoligenes_group与多种结合型胆汁酸（包括THCA、TCDCA、TUDCA、GUDCA、GCDCA和/或T-β-MCA）显示出负相关。Erysipelatoclostridium、Streptococcus、Turicibacter、Burkholderia、Caballeronia-Paraburkholderia、Bifidobacterium、Brevundimonas和Lactobacillus与这些胆汁酸显示出正相关。此外，还发现了一些属与次级胆汁酸呈现正相关或负相关关系。如Clostridiales、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Delftia、Dubosiella和Romboutsia与多种次级胆汁酸（包括DCA、HCA、HDCA、LCA、CDCA和UDCA）呈正相关，而Sphingopyxis、Allobaculum和Akkermansia与它们呈负相关。
图8. BAs与肠道菌群的关联分析
通过粪便微生物移植(Fecal microbiota transplantation, FMT)模型研究YTP2对肠道菌群的调控作用及其对NAFLD的潜在治疗影响。研究发现，YTP2干预可以改善由高脂饮食引起的肝代谢损伤和脂质沉积，并且通过16S rDNA测序显示了YTP2干预组与高脂饮食组在肠道菌群组成上的差异，YTP2→HFD治疗改变了Streptococcus和Lactobacillus的丰度，与YTP2组相似，特别是对于增加的分类单位。此外，YTP2干预还影响了胆汁酸的代谢，导致某些胆汁酸水平的变化。在蛋白质表达层面，YTP2干预影响了与胆汁酸代谢相关的蛋白质的表达。这些结果表明，YTP2→HFD组抑制Streptococcus和Lactobacillus可能诱导共轭BA合成并激活肝肠循环的替代途径。
图9. 粪便移植以研究YTP2对HFD诱导小鼠的影响
本文研究了大叶黄茶提取物中的多糖对NAFLD小鼠模型的治疗效果及其作用机制。研究通过肥胖特征分析和胆汁酸代谢评估，发现YTP能够显著改善NAFLD小鼠的脂质积累情况，并通过FMT及16s高通量测序技术揭示其调节肠道微生物群落和BAs代谢的分子机制。证明了YTP可能通过激活替代性的BA合成途径来减轻NAFLD的症状，为寻找针对NAFLD的新型治疗方法提供了新思路。
