发表期刊：Food & Function
影响因子：6.317
作者单位：福建医科大学
百趣提供服务：16S rDNA扩增子测序，胆汁酸检测
研究背景
高胆固醇血症，定义为过高的血清总胆固醇(total Cholesterol, TC)或低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)，是心血管疾病和阿尔茨海默病的重要危险因素。胆固醇稳态需要各组织和器官的合作，尤其是肠-肝轴。大量研究表明，胆汁酸(bile acids, BAs)、胆汁酸激活受体以及胆汁酸代谢细菌等在调节胆固醇稳态中发挥基本功能。胆汁酸的生物合成是胆固醇的主要分解途径，约40%的胆固醇可在肝脏中分解为胆汁酸。胆汁酸在肠内分泌后，通过肠道菌群进行解离和修饰，形成多种次级胆汁酸。已有研究阐明，肠道微生物除了调节胆汁酸的合成和代谢，也参与高胆固醇血症的促进和发展。因此，胆汁酸稳态可能是高胆固醇血症进展中肠道微生物群改变与肝细胞胆固醇代谢之间的联系之一。浒苔多糖(Enteromorpha prolifera, EP)具有多种生物学活性，但其在高胆固醇血症中的作用及其与肠道菌群的关系尚不清楚。
本研究选取50只C57BL/6J雄性小鼠，随机分为对照组(Control)、高脂高胆固醇饮食组(HFHC)、低剂量EP高脂高胆固醇饮食组(HFHC+LEP)、中剂量EP高脂高胆固醇饮食组(HFHC+MEP)和高剂量EP高脂高胆固醇饮食组(HFHC+HEP)，持续喂食12周后收集血清、肝脏和粪便样本，经过血清指标筛选最终选取对照组、HFHC和HFHC+HEP样本进行16S rDNA扩增子测序和胆汁酸检测，验证EP可通过肠道微生物-胆汁酸代谢轴改善高胆固醇血症小鼠代谢功能障碍的假设。
研究结果
1.EP可减轻高胆固醇血症和肝脏胆固醇沉积
12周喂食处理后，五组小鼠体重没有差异（图1A）。与对照组相比，HFHC组血清TC和LDL-C增加，高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)降低，表明HFHC组成功诱导了小鼠的高胆固醇血症。与HFHC组相比，EP干预显著降低血清TC水平（图1B）。此外，与HFHC组相比，只有高剂量EP干预显著降低了血清LDL-C浓度和肝脏指数，升高HDL-C水平（图1D-1F）。结果显示，EP干预可剂量依赖性地降低血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)水平（图1H），恢复肝功能。研究结果表明，高剂量（300mg/kgBW）EP对小鼠可显著缓解高胆固醇血症，并将高剂量EP干预用于后续研究。
图1. EP减轻HFHC小鼠高胆固醇血症
肝脏切片的组织病理学调查显示，HFHC组肝脏存在炎症病变，EP干预后炎症病变明显减轻（图2A）。此外，肝脏TC含量显示EP干预显著降低了肝脏胆固醇沉积（图2B），三组肝脏甘油三酯(triglycerides, TG)水平差异无统计学意义（图2C）。这些结果也表明，高剂量EP干预可显著缓解高胆固醇血症肝脏胆固醇沉积。
图2. EP可降低HFHC小鼠肝脏胆固醇沉积并恢复肝功能
2.EP促使与胆固醇吸收和消除相关的mRNA和蛋白质上调
为了探索EP降低肝脏胆固醇沉积的分子机制，本研究检测了胆固醇调节基因LDLR、SREBP2、HMGCR，以及胆汁酸合成相关基因CYP7A1、CYP27A在mRNA和蛋白质水平的表达情况。与HFHC组相比，EP干预使LDLR的mRNA水平和蛋白水平（图3A和3E）显著上调。此外，与HFHC组相比，HFHC+HEP组中胆固醇合成的主要转录调节因子SREBP2的mRNA和蛋白质丰度略有增强（图3B和3E）。与HFHC组相比，EP干预显著上调了肝脏中HMGCR的mRNA水平和蛋白丰度（图3B和3E）。
胆汁酸合成是胆固醇分解代谢和消除的重要途径。EP干预显著提高了调节胆汁酸合成的两种关键酶CYP7A1和CYP27A1的mRNA和蛋白水平（图3C和3E）。与喂食HFHC组相比，HFHC+HEP组中介导胆汁酸代谢的法尼类X受体(farnesoid X receptor, FXR)的基因表达上调（图3D）。总之，这些结果表明，膳食EP干预可以通过促进肝脏中胆汁酸的产生来缓解肝脏胆固醇沉积。
图3. 胆固醇调节基因的mRNA和蛋白质相对表达水平
3.EP干预重塑粪便微生物群落
为了加深肠道微生物因子与肝脏胆固醇代谢的潜在相关性，通过16S rDNA扩增子测序研究粪便微生物群落的组成。如图所示，三组间微生物Chao1指数和香农指数(Shannon-Wiener index, Shanon)无显著差异（图4A和4B）。通过Unifrac基于距离的主坐标分析(Principal Coordinates Analysis, PCoA)，发现HFHC组和对照组明显分离，HFHC组和HFHC+HEP组之间的样品也显著差异（图4C）。非度量多维标度(Non-metric multidimensional scaling, NMDS)分析显示HFHC+HEP组和HFHC组明显分离（图4D），表明EP干预诱导了肠道菌群组成的重塑。
图4. 不同饮食小鼠肠道菌群的α和β多样性分析
物种丰度分析结果表明，EP干预能显著提高门水平上拟杆菌门(Bacteriodetes)相对丰度，降低变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度（图5A、5B）。HFHC处理组拟杆菌门(Bacteriodetes)与变形菌门(Proteobacteria)比值降低，EP处理后显著升高（图5C），在属水平上也观察到类似的菌群变化（图5D）。所有样本属水平物种丰度统计显示，与对照组相比，HFHC组小鼠Escherichia_shigella、Parasutterella和Allobaculum属相对丰度增加，norank_f_Muribaculaceae和Ileibacterium的相对丰度降低（图5E）。
图5. EP可调节HFHC小鼠肠道微生物组成
采用线性判别分析(Linear discriminant analysis Effect Size, LEfSe)找到不同比较组间在丰度上有显著性差异的物种。HFHC+HEP组与HFHC+HEP组LEfSe分析结果显示，HFHC+HEP组Clstridium_sensu_stricto_13和Clostridiaceae_1显著富集，表明EP处理增强了肠道内稳态，重塑了粪便微生物群落。
图6. LEfSe分析结果
4.EP干预改变了粪便胆汁酸代谢模式
UHPLC-MS/MS靶向检测共鉴定出34种胆汁酸，其中有24种游离型胆汁酸和10种结合型胆汁酸。与对照组相比，HFHC组有10种结合型胆汁酸上调，7种游离型胆汁酸下调。与HFHC组相比，HFHC+HEP组结合型胆汁酸的比例明显降低，而游离型胆汁酸在三组间无统计学差异（图7A和7B）。总胆汁酸分析显示，与HFHC组相比，EP显著降低了粪便中牛磺酸结合型胆汁酸和甘氨酸结合型胆汁酸的含量（图7C和7D）。HFHC组小鼠胆汁酸的总水平也显著提高，约为对照组小鼠的10倍（图7E）。然而，EP治疗未引起总胆汁酸、初级胆汁酸和次级胆汁酸的显著变化（图7F和7G）。
图7. EP降低粪便中结合型胆汁酸含量
5.肠道菌群、粪便胆汁酸与血脂的相关性分析
为了探讨EP对肠道菌群-肠道-肝脏轴的潜在影响，作者采用Spearman相关分析检验血清TC、LDL-C和HDL-C与肠道菌群的关系。在门水平上，放线菌门(Actinobacteria)、髌骨细菌门(Patescibacteria)和拟杆菌门(Bacteriodetes)的相对丰度与肝脏指数、血清TC和LDL-C呈较强的负相关，而变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度与肝脏指数、血清TC和LDL-C呈正相关（图8A）。属水平上分析证实，主要的降胆固醇菌属有norank_f_Muribaculaceae、Ileibacterium、Candidatus_Saccharimonas、和Lachnospiraceae_NK4A136_group （图8B），它们与TC和LDL-C呈负相关。
通过Spearman相关分析，探讨了微生物与胆汁酸的相关性（图8C和图8D）。结果显示，变形菌门(Proteobacteria)相对丰度与总的结合型胆汁酸呈显著正相关(r=0.33，P=0.10)。相比之下，拟杆菌门(Bacteriodetes)门相对丰度与总结合型胆汁酸呈负相关(r=-0.40，P=0.03)。在属水平上，norank_f_Muribaculaceae与结合型胆汁酸呈负相关(r=−0.46，P=0.01)。
图8. 肠道菌群、胆汁酸和胆固醇相关指标的Spearman相关性分析
结论
本研究首次报道了EP干预可以通过调节肠道微生物群和胆汁酸代谢来缓解高胆固醇血症和肝脏胆固醇沉积。该结果加深了膳食益生元对全身胆固醇代谢影响的认识，激发了通过微生物-肠道-肝脏代谢途径治疗高脂血症的替代策略的发展。
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