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J Hazard Mater(IF=13.6) | 蛋白质磷酸化:大麦应对纳米塑料与氧化锌纳米粒子的关键调控因子
发布时间 2024-03-12

J Hazard Mater(IF=13.6) | 蛋白质磷酸化:大麦应对纳米塑料与氧化锌纳米粒子的关键调控因子(图1)

文章标题:Modulations in protein phosphorylation explain the physiological responses of barley (Hordeum vulgare) to nanoplastics and ZnO nanoparticles

发表期刊:Journal of Hazardous Materials

影响因子:13.6


研究背景


纳米材料作为纳米技术发展的物质基础,已在多个领域得到广泛应用。在农业方面,氧化锌纳米颗粒(ZnO nanoparticles, ZnO NPs)可用作纳米肥料施用,能够增加植物的光合碳同化、水分利用效率和胁迫抗性。但是过量施用ZnO NPs会限制根系发育,改变植物生理过程,影响植物生长和生产力。此外,纳米塑料(nanoplastics, nPS)的大量应用也会对植物组织造成物理和化学损伤。不过,目前对于nPS与其它纳米材料的相互作用以及对植物的综合影响在很大程度上是未知的。蛋白质磷酸化是蛋白质翻译后修饰(Protein post-translational modification, PTMs)的主要类型之一,通过将细胞间信号从受体传递到靶点,在植物感知和响应环境刺激方面发挥关键作用。蛋白质翻译后修饰可能有助于解释纳米材料对植物的生理影响。

该研究以大麦(Hordeum vulgare)为研究对象,对不同处理下的大麦进行了磷酸化蛋白质组学检测与分析,并验证了活性氧(reactive oxygen species, ROS)和碳水化合物代谢相关途径的变化。



技术路线


J Hazard Mater(IF=13.6) | 蛋白质磷酸化:大麦应对纳米塑料与氧化锌纳米粒子的关键调控因子(图2)


1. 植物形态、纳米塑料分布及生理特征
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本研究共设置了四个处理组:(1)ZnO处理组;(2)nPS处理组;(3)ZnO 和nPS的多重处理组(ZnPS);(4)对照组。对不同处理下的植物形态、纳米塑料分布及生理特征进行统计(图1)。结果显示,ZnO和nPS都可以进入大麦根部。三种处理中,ZnO和ZnPS处理均显著抑制大麦根和茎的生长,而单一nPS处理对大麦根和茎的长度没有显著影响,说明在共污染土壤中生长时,ZnO对大麦的生长起主要抑制作用。此外,与ZnO及nPS相比,ZnPS处理下的H2O2及ABA水平最高,表明纳米材料的组合处理对植物的毒性作用更大。

J Hazard Mater(IF=13.6) | 蛋白质磷酸化:大麦应对纳米塑料与氧化锌纳米粒子的关键调控因子(图4)

图1 ZnO和nPS对大麦吸收纳米塑料、形态和生理参数的影响

2.大麦叶片中磷酸化蛋白的鉴定
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对不同处理下的大麦叶片进行磷酸化修饰蛋白质组学检测,共鉴定到8642个磷酸化位点,3642个磷酸化蛋白(图2)。与对照组相比,ZnO、nPS和ZnPS组分别鉴定到106个、104个、173个差异磷酸化位点,84个、82个、132个差异磷酸化蛋白(differentially regulated phosphoproteins, DRPs),其中三组共有差异磷酸化位点37个,共有DRPs 35个。

J Hazard Mater(IF=13.6) | 蛋白质磷酸化:大麦应对纳米塑料与氧化锌纳米粒子的关键调控因子(图6)

图2 ZnO和nPS对大麦叶片磷酸化蛋白和磷酸化位点的影响

3.DRPs的GO和PPI分析
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对DRPs进行功能注释和亚细胞定位分析,结果显示在ZnO、nPS和ZnPS处理下,这些DRPs被分类到不同的功能类别中,主要涉及“碳水化合物转运和代谢”、“无机离子转运和代谢”、“转录”和“信号转导机制”等,DRPs以核定位蛋白居多,其次是叶绿体蛋白和细胞质蛋白。

GO富集分析表明,ZnO、nPS和ZnPS处理后的DRPs在多种细胞成分、分子功能和生物学过程中富集。ZnO处理后的DRPs主要与细胞组分中的光合膜、类囊体膜、叶绿体类囊体膜和细胞质染色体有关;在分子功能方面,主要富集于GTPase结合、Rho GTPase结合、纤维素合酶活性;在生物过程中,DRPs富集于植物型细胞壁组织、甘油脂生物合成过程、细胞多糖生物合成过程和植物型次生细胞壁生物发生过程。在nPS处理下,DRPs在细胞组分、分子功能和生物过程上均有富集,主要与细胞组分中的叶绿体类囊体膜蛋白复合物、非膜界细胞器和胞内非膜界细胞器有关;在分子功能上,DRPs与谷氨酸-5-半醛脱氢酶活性、氯离子跨膜转运活性、纤维素合酶活性、阴离子跨膜转运活性和多糖生物合成过程有关;此外,它们还参与了生物过程中的植物型次生细胞壁生物发生、细胞碳水化合物生物合成过程、植物型细胞壁生物发生、阴离子跨膜运输过程、细胞多糖代谢过程、无机阴离子运输过程。在ZnPS处理下,DRPs主要与细胞组分中的类囊体膜、光合膜、叶绿体类囊体膜、质体类囊体膜和质体类囊体膜间质有关;在分子功能上,DRPs与碳水化合物结合、谷氨酸-5-半醛脱氢酶活性、基础转录机制结合和蛋白质结构域特异性结合有关;在生物过程方面,DRPs富集于代谢过程和生物合成过程,包括RNA代谢过程、蜡质生物合成过程、中性脂质生物合成过程和核酸代谢过程。

使用String数据库对DRPs进行蛋白-蛋白相互作用分析(protein-protein interaction, PPI)。分析结果显示,PPI受不同处理的影响,在ZnO处理下,编码光采复合体II叶绿素/b结合蛋白6 (LHCB6)的M0ULA3负调控细胞色素b6f复合体(cytochrome b6/f complex)内电子转运相关蛋白A0A287HT89。

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图3 ZnO和nPS对DRPs调控PPI网络的影响

4.DRPs聚类分析
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对所有的DRPs 进行Mfuzz聚类分析(图5)。聚类1包括6个蛋白,与对照相比,ZnO、nPS和ZnPS处理的蛋白磷酸化水平逐渐升高。这些蛋白主要参与碱基切除修复和基础转录因子。聚类2包含3个蛋白,ZnO/Con的磷酸化水平高于nPS/Con和ZnPS/Con。聚类3包含8个蛋白,3种处理均显著提高了蛋白磷酸化水平,这些蛋白与光合生物的固碳、氮代谢和丙酮酸代谢有关。聚类4包含8个蛋白,与对照组相比,ZnO、nPS和ZnPS处理的蛋白磷酸化水平逐渐降低,这些蛋白与精氨酸和脯氨酸代谢途径以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径有关。聚类5包含5个蛋白,这些蛋白的磷酸化水平均显著升高,它们参与mRNA监视通路和RNA转运。聚类6包含9个蛋白,这些蛋白参与光合作用和自噬途径。

J Hazard Mater(IF=13.6) | 蛋白质磷酸化:大麦应对纳米塑料与氧化锌纳米粒子的关键调控因子(图10)

图4 DRPs的聚类分析

5.抗氧化酶活性
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在完全展开的叶片中,ZnO、nPS及ZnPS处理显著提高了POX活性,其他抗氧化酶活性不受单一纳米材料或组合纳米材料的影响(图6)。在ZnO、nPS及ZnPS处理下,根系中cwPOX活性及GR活性均有下降,其中GR活性分别降低了26.09%、49.63%和62.28%,GR活性降低了32.87%、61.96%和96.60%。此外,CAT、DHAR和POX活性也受不同处理的影响,其中,nPS和ZnPS处理的值较低。nPS处理下MDHAR活性显著降低57.08%,ZnPS处理下SOD活性显著升高71.02%。

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图5 ZnO和nPS对大麦叶片关键抗氧化酶活性的影响

6.叶绿体超微结构
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透射电镜图像显示,处理组和对照组的叶绿体均呈梭形或椭圆形(图6)。对照植株的叶绿体紧贴细胞壁,类囊体片层紧密堆积,含有大量淀粉粒。ZnO、nPS和ZnPS处理组细胞壁与叶绿体之间的距离长于对照植物。同时,类囊体肿胀,粒状薄片松动,且在ZnPS处理组中表现更为明显。综合研究结果表明,ZnO、nPS及ZnPS处理破坏了叶绿体的超微结构,表现为类囊体颗粒片层排列的破坏。

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图6 ZnO和nPS对大麦叶片叶绿体超微结构的影响

7.碳水化合物代谢酶活性
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在叶片的蔗糖降解途径中,nPS处理后的液泡转化酶活性和ZnPS处理后的细胞壁转化酶活性分别比对照组高出35.18%和20.53%(图7)。与对照组相比,nPS显著降低了根部cytInv和vacInv的活性,而ZnO只降低了vacInv的活性。ZnO处理组中Susy活性比对照组高出51.21%,而ZnPS处理组和对照组之间相似。在叶片的糖酵解途径中,ZnO和ZnPS处理下HXK的活性分别是对照组的3.14倍和3.24倍。PGI活性在ZnO、nPS及ZnPS处理下分别增加了32.07%、36.27%和43.92%。叶片中的Ald活性以及根部的HXK、PFK、PGI和Ald活性不受任何单一纳米材料或其组合的影响。对于叶片中的淀粉生物合成途径,nPS处理下的AGPase活性显著降低了75.39%,而ZnPS处理下的PGM活性增加了20.77%。在根部,nPS处理下的PGM活性显著降低了41.43%,AGPase活性不受处理的影响。在根部的蔗糖生物合成和氧化戊糖磷酸途径中,nPS处理植物的FK活性比对照组高出9.52倍,而G6PDH活性比对照组低了44%。此外,UGPase活性不受任何单一纳米材料或其组合的影响。

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图7 ZnO和nPS对大麦叶片关键碳水化合物代谢酶的影响


研究总结


该研究以大麦为研究对象,设置了不同的处理组,以探究ZnO、nPS以及组合处理对植株的影响。结果发现,ZnO与nPS的多重处理会增加大麦根系中H2O2和ABA的积累,抑制其根系伸长和叶片生长。结合磷酸化蛋白质组学研究发现,在纳米材料共暴露下,大麦叶片中有132个差异磷酸化蛋白和173个差异磷酸化位点,这些磷酸化位点与光合作用、碳固定、氮代谢以及精氨酸和脯氨酸代谢有关。这些过程与转化酶、Susy、PFK和G6PDH活性的变化密切相关。此外,复合纳米材料暴露通过抑制水分和矿物质的吸收、诱导气孔关闭和减少光合碳同化对大麦植株造成更大的伤害。总体而言,与单一纳米材料处理相比,多种纳米材料复合处理会对植物抗氧化和碳水化合物代谢系统造成更严重的损害。


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