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科普 | 精细化取样技术之激光捕获显微切割(LCM)

无论是做代谢组学研究还是基因组、蛋白组、分子生化,第一步就是样本收集。可以说样本收集是整个实验的基石,直接决定了下游数据质量。如果取样不当,不但浪费了大量的人力物力还浪费了宝贵的时间,会导致延期毕业哦(研究僧的噩梦)~


代谢组学


对于代谢组学研究而言,谈到样本收集,样本繁多的类型是绕不开的话题。液体、固体甚至气体都可以拿来做代谢组学检测分析研究。对于组织样本由于存在不均一性,导致随机取样的时候会出现很大的差异。比如番茄之类的果实,从外到内,组织上有显著的差异,物质成分也有很大差异。


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而精细取样技术就是为了解决此类问题而诞生的一系列技术。今天跟大家科普一下激光捕获显微切割技术:即Laser capture microdissection (LCM) technology,是在不破坏组织结构,保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下,直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞 ,通常用于从组织中精确地分离一个单一的细胞。 该技术由美国NIH肿瘤研究所的Emmert-Buck等科学家于1996年研发(该工作发表在Science期刊上)【1】,并在次年实现商品化销售。


该方法具有以下特点:

无需精巧的手工操作技能,所需标本量少,细胞收集率高,分离速度快;

目标细胞的组织同质性高,能在目视下从样品中特异的挑选出同类细胞甚至单一细胞,从而降低了间质细胞和坏死组织及其他可能影响结果分析的杂志成分的干扰;

保持目标捕获细胞和剩余组织形态特征的完好;

各种技术参数和操作流程相对成熟,操作过程稳定,可控性强。


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激光捕获显微切割系统按照功能可以分为:倒置荧光显微镜、激光系统、载物平台3部分,分别负责观察、切割、捕获。这些“大件”的基本原理大家如想了解可以进一步检索相关资料或者直接咨询相关公司即可,在这里想要强调的是“transfer film”。

Transfer film是乙烯乙酸乙烯酯(ethylene vinylacetate,EVA)膜,约100~200μm厚,能够吸收激光产生的绝大部分能量,在瞬间将激光束照射区域的温度提高到90°C,保持数毫秒后又迅速冷却,保证了生物大分子不受损害。采用低能量红外激光的同时也可避免损伤性光化学反应的发生【2】。在激光脉冲照射下,EVA膜局部高温后熔化,渗透到切片上微小的组织间隙中,并迅速凝固,从而将切割下来的组织粘贴起来“捕获”住并转移到离心管中。


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除了上面这种技术外,还有一个类似的技术:激光显微切割技术。对,没错!没有“捕获”。原理更加简单粗暴:切割下来的组织靠自身重力掉落到收集槽内完成“捕获”动作。正如该商家宣传的一样“重力始终有效”。


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激光显微切割技术除了可以切割组织切片外,还可以切割大脑组织、植物甚至骨骼、牙齿。不由自主地在脑海中浮现出星战电影中威武雄壮的“大宝剑”……


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讲到这里,耳边肯定响起了:“998!只要998!走过路过不要错过”的魔性广告音了。不过放心,少年别走,BIOTREE不会要求你办卡的。这套设备要100多万软妹币……听着牛B闪闪,但好像又没什么卵用……好像做个PCR、测个序没什么问题,做蛋白组、代谢组行不通吧?切下来的那么点样本,就不要为难质谱仪了……

随便上SCI神站上一搜,就找到一篇还热乎的做番茄LCM蛋白组研究的文章【4】,发表在Analytical Chemistry上。作者取了一个未成年的小番茄,切割后取外表皮(OE)、厚角组织(Col)、薄壁组织(Par),分别5个重复。


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取样面积越大鉴定出来的蛋白和多肽越多…好像是废话,不过还是秀出来图吧,这样显的篇幅长、工作量大(写毕业论文的小伙伴都深有体会LOL~)。


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然后作者对检测出来的蛋白进行了通路分析,常规操作~然后发现3种不同部位样本中的蛋白功能上有显著的区别。概括地讲就是从外到内,能量代谢活动越来越旺盛。作者在最后讨论里也这对这个现象进行了进一步推测:内部的薄壁组织(Par)才是能量代谢的主要发生区域,而不是叶绿体富集的表层(OE)。能量代谢产生的糖类以淀粉、蔗糖的形式存储在薄壁组织内。


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好了,聊到这里也就接近尾声了,不过我们的思绪可以再发散一下。如果用不同时期的果实来进行研究会是什么样的结果呢?如果用激光将果实上下、左右、前后切割成很多的正方体小块,每一块都去做基因组、蛋白组、代谢组会不会更能对果实发育研究的更透彻呢?如果把番茄换成大脑组织呢?如果……尼玛!又想骗我去做科研!


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【1】Emmert-Buck M R, Bonner R F, Smith P D, et al. Laser capture microdissection[J]. Science, 1996, 274(5289): 998-1001.

【2】Simone N L, Bonner R F, Gillespie J W, et al. Laser-capture microdissection: opening the microscopic frontier to molecular analysis[J]. Trends in Genetics, 1998, 14(7): 272-276.

【3】Bonner R F , Emmertbuck M , Cole K , et al. Laser Capture Microdissection: Molecular Analysis of Tissue[J]. Science, 1997, 278(5342):1481-1483. 

【4】Liang Yiran,Zhu Ying,Dou Maowei et al. Spatially Resolved Proteome Profiling of <200 Cells from Tomato Fruit Pericarp by Integrating Laser-Capture Microdissection with Nanodroplet Sample Preparation.[J] .Anal. Chem., 2018, 90: 11106-11114. 


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