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文献分享 | 三组学整合分析在中医药研究中的应用


组学研究中经常会涉及到转录组-代谢组、代谢组-蛋白组等两个组学之间的关联分析,但小伙伴们有碰到过代谢组、转录组、蛋白组3个组学的整合研究吗?本周,Biotree技术支持部的小伙伴Mandy和大家分享一篇代谢组、转录组和蛋白组3组学整合分析的文献。

文章题目为:System biology analysis of long term effect and mechanism of Bufei Yishen on COPD revealed by system pharmacology and 3-omics profiling。该文2016年发表在Scientific Reports上,是关于中药药理方面的研究。

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前言

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种具有气流阻塞特征的慢性支气管炎和(或)肺气肿,可进一步发展为肺心病和呼吸衰竭的常见慢性疾病。与有害气体及有害颗粒的异常炎症反应有关,致残率和病死率很高,全球40岁以上发病率已高达9%~10%。

补肺益肾方(BYF)是一种由12种中草药组成的中药配方,临床上已被证实对COPD具有较好的治疗效果。然而,目前BYF对COPD的长期影响和治疗机制仍不清楚。

本研究通过转录组学 - 蛋白质组学 - 代谢组学的整合分析,并结合系统药理学分析了BYF的长期治疗效果和潜在机制,发现BYF可能通过从系统层面调节脂质代谢、氧化应激、细胞连接和炎症反应途径对COPD发挥长期治疗作用。

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研究方法

样本收集:

第0~8周建立COPD大鼠模型,第9周~20周每天给药治疗1次,第32周处死大鼠,取肺组织用于后续检测。

检测方法:


转录组:Microarray(大鼠全基因组表达谱芯片)

蛋白组:LC-MS

代谢组:LC-MS

数据分析:

Agilent GeneSpring GX sofware 11.0

SIMCA-P:PLS-DA

BINGO(Cytoscape v3.1.1插件)、ClueGO(Cytoscape插件):分子功能注释

MetaboAnalyst 3.0:Pathway analysis

SPSS 19.0:ANOVA

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结果与讨论

呼吸系统检测:

首先,在第0~32周,每4周测一次呼吸数据:潮气量(TV)、呼气峰值流量(PEF)和50%潮气量呼气流量(EF50),进而评估肺功能。结果显示:与对照组大鼠相比,模型组大鼠从第4周到第32周,潮气量(TV)、呼气流量峰值(PEF)和50%潮气量呼气流量(EF50)明显降低,但BYF会明显减少这种降低水平,如图1 所示。

代谢组学

图1  BYF对COPD大鼠肺功能的长期影响(*p< 0.05 vs. Model)


组织病理检测:

模型大鼠的肺损伤评分、细支气管壁厚度、小肺血管壁厚度、细支气管狭窄和肺泡直径都明显增加,这可以通过BYF治疗得到显著的抑制。此外,BYF治疗也显著增加了COPD大鼠的肺泡数量。如图2所示,这些数据表明BYF治疗对COPD大鼠具有长期治疗效果。

代谢组学

图2  BYF对COPD肺组织组织学变化的长期影响(*p< 0.05, **p< 0.01 vs. Model)


通过测试BYF对肺组织中炎症介质表达的长期影响,发现COPD模型组大鼠中,IL-6、IL-1β、TNF-α和sTNFR2的水平增加,并且这种增加受到BYF的显著抑制,如图3所示,这些结果证明,在第32周,BYF治疗可以有效地抑制肺组织中的炎症反应。


代谢组学

图3  BYF对COPD大鼠IL-1β、 IL-6 、TNF-α和sTNFR2表达的长期影响(**p< 0.01 vs. model)

蛋白酶-抗蛋白酶失衡导致结缔组织的分解,并诱导肺实质的破坏和肺气肿的发展,这是COPD中关键的发病机制。有研究显示,在COPD患者的支气管肺泡灌洗液中观察到MMP-2和MMP-9浓度增加,肺实质中MMP-9活性增加,TIMP-1活性降低[1,2]。此外,COPD中的胶原沉积对持续性组织损伤至关重要,并且诱导气流阻塞[3]。

作者通过检测BYF对肺组织中MMP-2,MMP-9,TIMP-1和 胶原蛋白I,III和IV表达的长期影响,发现BYF显著降低了MMP-2和MMP-9的表达水平并增加了TIMP-1的表达水平(图4),且显著降低了胶原蛋白 I,III和IV的表达(图5)。这些结果表明,BYF在第32周可通过降低胶原蛋白 I,III,IV和MMP-2/9的表达,增加TIMP-1的表达来抑制胶原沉积和蛋白酶-抗蛋白酶失衡。

代谢组学
图4  BYF对COPD大鼠MMP-2, MMP-9 and TIMP-1表达的长期影响(*p< 0.05, **p< 0.01 vs. model)

代谢组学
图5  BYF对COPD大鼠 collagens I, III, IV表达的长期影响(*p< 0.05, **p< 0.01 vs. model)

以上的结果总的来说都表明BYF对COPD大鼠具有长期治疗作用!那么这种长期作用的机制是什么呢?很羞愧上面说了那么多非重点,接下来就是本次分享的重点了。

基因层面:

通过大鼠全基因组表达谱芯片技术,检测到大约41000个基因,经分析发现在COPD模型组(VS对照组)和BYF治疗(VS COPD模型)组中分别有1063和1106个差异基因。然后对这些差异基因进行了分子功能注释,发现这些基因可归因于各种分子功能,例如氧化还原酶活性、金属内肽酶活性、激素受体结合或NF-κB结合(图6)。 

代谢组学
图6  COPD大鼠(A)和BYF治疗大鼠(B)肺组织调控基因的分子功能

蛋白质层面:

用基于LC-MS的蛋白质组学数据分析,发现在COPD模型(VS对照)和BYF处理的大鼠(VS COPD模型)分别筛选到191和187个差异蛋白。同样对这些差异蛋白进行分子功能注释,发现这些调节蛋白的分子功能与氧化还原酶活性、过氧化还原酶活性或NAD结合有关(图7A、B)。

代谢组学
图7  COPD大鼠(A)和BYF治疗大鼠(B)肺组织中蛋白的分子功能

进一步分析发现,COPD模型组(191种蛋白质)与BYF处理组(187种蛋白质)共享有132种常见蛋白。在这132种蛋白中,COPD模型组在BYF治疗后有70种共有蛋白质表达受到抑制,且主要与氧化还原酶活性、抗氧化活性、细胞外基质结合和蛋白磷酸酶结合分子功能有关,这可能是BYF作用的治疗机制(图7C)。

代谢组学
图7C  COPD大鼠与BYF治疗大鼠之间重叠蛋白的主要功能

代谢物层面:

最后,对代谢组学数据分析,发现在COPD模型(VS对照)和BYF治疗(VS COPD模型)大鼠中分别有41和32种差异代谢物,经MetaboAnalyst通路分析发现,发现这些代谢物主要参与花生四烯酸、亚油酸或谷胱甘肽的代谢(图8)。后面通过网络互作分析发现这些代谢异常主要与脂质代谢有关。

代谢组学
图8  COPD大鼠(A)和BYF治疗大鼠(B)肺组织代谢物的通路分析

以上就是作者做的各组学的研究内容和分析策略啦!3个组学的研究思路基本一致,通过上述研究中,成功鉴定了许多受调节的基因、蛋白质和代谢物,这些可能与BYF对COPD的治疗效果有关。

那么这就完了?很明显没有!后面作者通过整合转录组学、蛋白质组学和代谢组学数据分析了基因、蛋白质和代谢物的系统功能,这样才能为BYF对COPD的治疗机制提供全面系统的解释。

互作网络分析:

通过Metscape软件构建相关网络图。代谢物 - 基因网络结果表明这些网络主要分为两组,即脂代谢和能量代谢,且大部分代谢产物和许多基因参与的是脂质代谢(图9A,B)。代谢物 - 蛋白质网络结果显示该网络主要由脂质代谢或谷胱甘肽代谢组成,且超过一半的蛋白质和几乎所有代谢物都参与了脂质代谢(图9C,D)。那么则可预测脂质代谢紊乱与COPD的发生和发展以及BYF的长期治疗效果密切相关。

代谢组学
图9  COPD大鼠与BYF治疗大鼠肺组织中代谢物、基因和蛋白的互作网络 

系统药理学与各组学整合分析:

将转录组学,蛋白质组学和代谢组学数据流与系统药理学目标数据相结合,以全面系统地了解BYF对COPD的长期治疗机制。

分析发现,在BYF潜在靶点和BYF处理组大鼠的转录检测结果之间有8个重叠蛋白(katA, MAPK14, ACHE, ADRB1, CALM1, ADRA2B, ampC, gyrB),涉及分子功能主要有MAP激酶活性、肾上腺素能受体活性、乙酰胆碱酯酶活性、乙酰胆碱结合和细胞外基质结合(图10A)。在BYF潜在靶点和BYF处理组大鼠的蛋白检测结果之间有9个重叠蛋白(ampC, ATP5B, CALM1, COL1A2, gyrB, HSPA5, katA, SOD1 XDH),涉及的分子功能主要为氧化还原酶活性、抗氧化活性、黄嘌呤脱氢酶/氧化酶活性(图10B)。

代谢组学
图10  重叠蛋白的分子功能

最后,使用Metscape软件,通过构建相关网络,分析了调节BYF治疗大鼠的代谢物和靶蛋白之间的潜在关系,发现代谢物 - 靶蛋白网络主要由脂质代谢组成(图11)。

代谢组学
图11  BYF治疗大鼠代谢物和靶蛋白的代谢相关网络

通过以上综合分析,则为BYF治疗COPD的长期效应机制提供了的全面系统的解释。这些结果说明BYF通过调节多种生物学途径如脂质代谢、炎症反应、氧化应激、局灶性粘连途径对慢性阻塞性肺病有长期疗效(图12)。

代谢组学
图12  BYF潜在靶点和BYF治疗大鼠肺组织的转录组学、蛋白质组学和代谢组学的综合分析

好啦!以上就是这篇文章的最后结果了,得出的结论总的来说有:COPD和BYF治疗的大鼠中受调节的转录物、蛋白质和代谢物归因于多种分子功能,例如氧化还原酶活性、抗氧化活性和脂质代谢;且BYF可能通过调节脂质代谢、炎症反应、氧化应激和系统水平的局灶性粘连途径实现其对COPD的长期治疗作用。

参考文献:
[1]Culpitt, S. V. et al. Effect of high dose inhaled steroid on cells, cytokines, and proteases in induced sputum in chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 160, 1635-1639 (1999).
[2]Finlay, G. A. et al. Matrix metalloproteinase expression and production by alveolar macrophages in emphysema. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 156, 240-247 (1997).

[3]. Leeming, D. J. et al. Serological investigation of the collagen degradation profile of patients with chronic obstructive pulmonary disease or idiopathic pulmonary fibrosis. Biomark. insights 7, 119-126 (2012).


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