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文献分享 | 代谢组学中复溶溶剂究竟如何选?

代谢组学


今天,BIOTREE 技术支持工程师Novenia 将和奋斗在实验室的小伙伴们分享一篇关于代谢组学实验过程中溶剂选择的文章Tuning Metabolome Coverage in Reversed Phase LC−MS Metabolomics of MeOH Extracted Samples Using the Reconstitution Solvent Composition。这是一篇2017年发表在analytical chemistry的文章,影响因子6.042。


大家都知道做代谢组学实验的时候,因为生物样本中包含了太多的物质,不可能使用一种仪器或者一种方法就可以把所有的物质都检测出来,所以衍生出非靶标代谢组学。

非靶标代谢组学的目的是尽可能多的检测样本中的代谢物,但是无论是GC 还是LC,都会碰到一个问题,就是什么溶剂可以将提取干燥过的代谢物尽可能多的复溶呢。小白可能会去看文献,结果发现一千篇文章有一千种复溶溶剂,大神则会根据自己的经验来选择复溶溶剂。终于,在2017年的某一天,有人站出来针对LCMS去做对比了,让我们携手去看一下这位大神的实验结果吧!

首先,大神准备了三种样本,40例人血清(20例健康,20例疾病),LB培养基以及没有在正文结果中出现的酵母菌,用甲醇进行提取或者沉淀蛋白后干燥,再用不同比例以及不同pH的甲醇来进行复溶,最后用LC-qTOF进行检测。详情如下图:


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其次,让我们一起来看一下实验结果。

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复溶溶剂对检测到的峰的影响

首先是LB培养基的结果。


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Figure 1. Total number of detected metabolite features (y-axis) as a function of (top) the MeOH/H2O ratio expressed in % MeOH (x-axis) .

第一个图是色谱图的峰数量随甲醇比例的变化,第二个是根据定性出来的代谢物峰面积做了个PCA模型,果然,明晃晃的数据显示复溶试剂中甲醇的比例与代谢物的检测具有明显的关系,随着甲醇比例的升高,可以检测到的峰的数量在减少。

再看pH。


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Figure 2. Total number of detected metabolite features (y-axis) as a function of (top) the MeOH/H2O ratio expressed in different pH.

这个数据就没有那么明晃晃了,检测出来的峰数量没有肉眼可见的明显差异,代谢物的峰面积虽然有个趋势却又有一些混乱看不清楚,所以大神决定将这个条件放弃,专心研究甲醇的比例。

接下来,大神将10种标准品加到LB培养基里,研究复溶溶剂与物质极性有没有关系。他在这里使用指数log P来表示物质极性的大小,log P越大,极性越小。

虽然不知道为什么,但是感觉很厉害的样子。结果发现log P小于5的物质的响应,如ATP、亚精胺都随着甲醇比例的减小而增加,而log P为7的棕榈酸则随着甲醇比例的减小而减小,由此可见复溶溶剂的极性与物质的极性是相关的。

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Figure 3. Examples of EICs for selected spiked in metabolites in different MeOH ratios, as indicated by orange and blue.

最后,根据log P来预测了一下HMDB中的人血清的数据,这是一个预测的数据。

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Figure 4. The predicted log P distribution (x-axis) of all known metabolites in human blood as listed in the Human Metabolome Database (HMDB).

对HMDB里面的大约13000中物质按照极性进行分类,也就是给每个物质一个预测的log P值,结果显示log P小于5的有74%,也就是说极性大的物质比较多,因此做血清实验的时候,使用亲水的溶剂更好。log P大于7的只占19%,表明使用亲水的复溶溶剂可能难以将这些物质检测出来。

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不同比例甲醇复溶得到的代谢物的量的变化

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Figure 5. Effect of reconstitution solvent composition on metabolome coverage.

首先非靶标检测。用100%水和100%甲醇复溶,分别得到了检测到的物质列表,并作为接下来靶标实验的目标物质。

其次,用0%甲醇、50%甲醇、100%甲醇复溶,分别检测非靶中得到的物质。结果分析:50%甲醇与0%甲醇相比,fold change小于1的占57%,大于1的仅占5%;50%甲醇与100%甲醇相比,fold change不变的占61%,大于1 的占28%。结果表明用水提取时,干燥后加甲醇可能会导致物质的丢失,而用甲醇提取时,干燥后加水的影响不大。

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复溶溶剂对差异物的影响

最后,大神研究了复溶溶剂对差异物的影响,毕竟我们做代谢组学就是为了寻找差异物。

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Figure 6. Work flow for metabolomics comparison of MeOH extracts of serum from 20 healthy control individuals and 20 lymphoma patients using three different reconstitution mixtures.

通过两组样本的比较,使用了三种复溶溶剂,非靶标检测最后得到的结果显示差异很大。100%复溶后检测可以找到6种差异物,然而50%甲醇以及100%甲醇没有找到差异物。

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Figure 7. Box-whisker plots for N-Acetyl-methionine which was one of the six metabolites that significantly differed between control and lymphoma patients (left).

然后大神就对其中一个物质进行分析,发现这个物质在50%甲醇及100%甲醇中峰型极差,尤其是100%甲醇中的峰型可能都不会被软件定性为一个物质。所以复溶溶剂对差异物的筛选有很大影响,选择复溶溶剂是一件很重要的事。

好了,所有的实验都做完了,也分析完了,那么最后我们能得到什么结论呢?

对于血清样本来说,100%水的溶剂比较好,除此之外的其他样本,亲水的溶剂比较好。大家在投稿的时候有可能会被问为什么这么选择复溶溶剂,那么这篇文章也许可以作为一个证明材料。

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文章延伸

小伙伴们知道文中貌美如花的PCA图是用什么软件完成的吗?小编偷偷地告诉你哟,是神通广大的SIMCA软件。

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