全国免费热线: 点我留言
当前位置:首页 > 百趣动态 > 研究动态

文献分享 | 利用去除磷脂固相萃取及LC-MS对小鼠及人血中胆汁酸进行代谢分析


大家好!今天与大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章"Metabolic Profiling of Bile Acids in Human and Mouse Blood by LC−MS/MS in Combination with Phospholipid-Depletion Solid-Phase Extraction"。

代谢组学


研究背景

胆汁酸具有多方面重要的生理功能,例如,促进脂类、胆固醇及脂溶性维生素吸收;作为信号分子调控肝肠系统糖及脂类代谢;调控自身合成与分泌等。

肝、胆管疾病,如急性肝炎、肝硬化、原发性肝癌、急性肝丙胆汁淤滞、肝外阻塞性黄疸等均引起胆汁酸含量的显著变化,因此,准确定量胆汁酸对疾病诊断具有指导作用。

LC- MS是实现生物样本中胆汁酸准确定量的有效方法,截止作者发稿前,最多32种胆汁酸在UPLC-MRM-MS中被准确定量。

本文基于MRM检测模式,定量人、鼠血浆中50种胆汁酸,是目前定量数量最多的报道,这50种胆汁酸中包括游离的四羟基胆汁酸(THBAS)、酮基胆汁酸、游离和结合型的别胆酸,其中大部分均首次在UPLC-MRM-MS中使用。本文意在利用UPLC-MRM-MS来检测、定量样本中复杂的胆汁酸。

实验方法

实验样本

6例8周雌性野生型小鼠血浆及6例8周雌性mdr2-/-敲除型小鼠血浆;7个健康志愿者进食多脂食物1h及三周后空腹血浆样本。

标品配置及标线建立

内标贮备液:50%甲醇配制浓度为100 ng/mL 14个氘标记的胆汁酸混合液。

标准品贮备液:甲醇(50%甲醇)溶解游离型胆汁酸(结合胆汁酸)标准品制备成浓度为1 mg/mL标准品储存液。

标准溶液:50%甲醇将储备液稀释0.002−20μg/mL,每个浓度点加入等量的IS。

样本前处理

作者用剔除磷脂固相萃取(PD-SPE)法 、蛋白沉淀 (PPT)法、反向固相萃取(SPE)法、高pH反向固相萃取 (hipH SPE) 4种方法处理样本,正文中,作者着重介绍了第一种方法。

LC-MS仪器参数

液相条件

代谢组学

质谱条件


离子源:ESI,-4400V

检测模式:负离子模式

游离型胆汁酸:由于该类物质子离子丰度低(LCA没有任何子离子产生),在Q1及Q3中均采用(M−H)−离子监测模式。结合型胆汁酸:采用至少两对离子的MRM模式。

实验结果

样本处理方法

3类胆汁酸中各选择3种代表的胆汁酸,测定其在不同样本处理方法下样本中含量,7种胆汁酸用PD-SPE处理方法中,有最大的峰面积与最小的标准差,如图1。

为了进一步验证不同方法去除磷脂类物质能力,应用UPLC-in-source CID/MRM-MS检测不同处理方法下,样本中磷脂类物质含量,图2中可知,相比蛋白沉淀方法,PD-SPE处理的样本中磷脂类物质几乎未被检测到,PD-SPE具有显著去除磷脂类物质的能力,提高了胆汁酸检测能力,尤其是对于保留时间在20min-26min脂溶性的胆汁酸。

代谢组学
图1:剔除磷脂固相萃取(PD-SPE)法 、蛋白沉淀 (PPT)法、反向固相萃取(SPE )法、高pH反向固相萃取 (hipH SPE) 4种处理样本方法比较,柱形图为不同样本中胆汁酸平均含量+SD:A:游离型胆汁酸;B:甘氨酸结合型胆汁酸;C:牛磺酸结合型胆汁酸。

代谢组学
图2:不同方法去除磷脂能力A:人血中PD-SPE处理方法中残留磷脂色谱图;B:人血中PD-SPE处理方法中残留磷脂色谱图。

50种胆汁酸分离及检出效果良好

对于50种胆汁酸,其中42种具有同分异构体,这些同分异构体多数具有相同的碎片离子对,因此,色谱条件对于分离、定性、定量胆汁酸具有决定性作用。BEH C18 UPLC色谱柱具有最好的分离效果,通过作者研究发现,上述液相条件具有最好的分离效果,能够准确分离50种胆汁酸,除了牛磺猪去氧胆酸与牛磺熊去氧胆酸峰有部分重叠。这50个胆汁酸包含30个游离型胆汁酸,8个甘氨酸结合胆汁酸,12个牛磺酸结合的胆汁酸。
代谢组学
图3:50种胆汁酸及14种氕带标记的胆汁酸TIC图

良好的灵敏性、准确度及稳定性

方法的灵敏度以检测物质的检出限及定量限表示,50种胆汁酸的检出限及定量限如下图4;方法的准确度以加标回收率衡量,对于样本中定量到的胆汁酸以含量的100%、250%加标计算其加标回收率,样本中未定量到的胆汁酸以定量限5倍加标,此处统一在图5中表示;方法稳定性以日内RSD与日间RSD衡量,此处图6罗列了样本日间RSD。

代谢组学

代谢组学

代谢组学


进食与非进食状态下人血中BAS含量测定

在人血中,43种胆汁酸能够被准确定量,当中包括很多低含量及未被报道过的胆汁酸,如3α, 6β, 7α, 12α-THBA、3α, 6α, 7α, 12α-THBA,这是在人血样本中能够一次性定量胆汁酸种类最多的报道。在非进食条件下,胆汁酸含量明显比进食条件下要高, 且不同胆汁酸含量比发生变化,主要的三种胆汁酸为胆酸(CA)、鹅去氧胆酸(CDCA)、脱氧胆酸(DCA),其摩尔含量比在非进食条件下为15:55:30,而在进食条件下其含量比为20:52:28。

野生型小鼠与mdr2-/-敲除型小鼠血浆胆汁酸代谢

野生型和突变型小鼠中分别有38和44种胆汁酸可被定量,这表明在小鼠血样本中,大部分胆汁酸可以被检测、定量。该开发方法对于定量样本中复杂胆汁酸含量具有实际应用价值。突变体中胆汁酸总含量是野生型的69.4倍,在敲除型小鼠中胆汁淤积。除此之外,胆汁酸种类也发生明显变化,野生型小鼠主要是牛磺酸结合型胆汁酸(51.1%)和游离胆汁酸,mdr2-/-敲除型小鼠中主要是牛磺酸结合型胆汁酸(92.2%-99.1%),胆汁淤积小鼠与正常小鼠血中胆汁含量与组成有显著的不同。

发现潜在未知胆汁酸

对于含有0-4个羟基的牛磺酸及甘氨酸结合型胆汁酸及游离的四羟基胆汁酸(THBAS),运用UPLC-MRM-MS模式,检测未知胆汁酸,去簇电压、碰撞电压等参数为每组物质中所有同分异构体参数平均值;含有1-3个羟基的游离型胆汁酸,不需要运用MRM。运用UPLC-Fourier transform (FT)对该方法进一步验证,其结果与应用UPLC-MRM-MS方法相符。

代谢组学
图6:应用UPLC-MS/MS,发现样本中未报道的游离型4羟基胆汁酸
研究结论

剔除磷脂固相萃取(PD-SPE)法显著提高了分离50种胆汁酸效力,提高检测灵敏度。该方法通过色谱、质谱条件优化,实现了生物样本中50种胆汁酸定量,该方法最大检出限为0.41nM,最大定量限为1.62nM,具有良好的灵敏度;多数物质加标回收率在80%-120%,准确度较高。用该方法检测样本中物质含量,日内RSD1.0%-9.3%、日间RSD1.4%-10.8%,具有很好的稳定性。同时,该方法检测到15种牛磺酸结合的四羟基胆汁酸,9种游离的四羟基胆汁酸此前未被报道。5

文章延伸

2018年,上海阿趣生物科技有限公司隆重推出胆汁酸高通量靶标定量检测分析服务。胆汁酸高通量靶标定量采用适宜的样本前处理方法,能够充分提取样本中胆汁酸物质,此外通过构建的标品数据库,每个物质选择最优离子对定量检测,能够确保定性定量准确。

代谢组学

有兴趣采用此技术进行样品检测分析的老师,欢迎垂询服务热线:400-664-9912。


代谢组学